Генная терапия трансгенными клетками

фото Генная терапия трансгенными клетками
Терапию трансгенными клетками с целевой генно-инженерной конструкцией можно назвать комбинированной. Для ее осуществления необходимо ввести целевой ген в клетку. Такая комбинация сочетает свойства клеточного вектора, генной функции и эффект клеточной терапии.

Трансгеноз (перенос генетического материала) in vitro направлен на соматические клетки-мишени, заранее выделенные из организма (например, резецированная печень, культура лимфоцитов или фибробластов, костный мозг, опухолевые клетки). Для введения ДНК в клетки млекопитающих использованы многие подходы: химические (микропреципитаты фосфата кальция, DEAE-декстран, диметилсульфоксид), слияние клеток (микроклетки, протопласты), физические (микроинъекции, электропорация , лазерная микроинъекция) и вирусные (ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы). Невирусные методы, за исключением электропорации и лазерной микроинъекции, малоэффективны. Наиболее эффективные переносчики ДНК в клетки - «природные шприцы» - вирусы.

Процедура трансгеноза клеток должна заканчиваться проверкой ее успешности. Трансгеноз можно считать успешным, если не менее 5% всех обработанных клеток будут иметь введенный генетический материал.

Конечная процедура генной терапии через трансгеноз соматических клеток in vitro - реимплантация трансгенных клеток-мишеней.


Она может быть органотропной (печеночные клетки вводят через воротную вену) или эктопической (клетки костного мозга вводят через периферическую вену).

Клеточно-генная терапия была принята в клинической практике быстрее, чем можно было ожидать. Варианты ее применения можно показать на примере трех болезней.

Недостаточность аденозиндезаминазы. Лимфоциты больной девочки в возрасте 4 лет (США), страдающей первичным иммунодефицитом, обусловленным мутацией в гене аденозиндезаминазы, были заранее отделены от остальных элементов крови, а Т-лимфоциты стимулированы к росту. Затем in vitro с помощью ретровирусного вектора в них был введен ген аденозиндезаминазы. Приготовленные таким образом генно-инженерные лимфоциты были возвращены в кровоток.

Из протокола клинического испытания стало ясно, что, во-первых, лимфоциты пациентов с тяжелым иммунодефицитным состоянием могут быть изолированы и выращены в лабораторных условиях. В них можно ввести ген и возвратить в кровоток больного. Во-вторых, лечение больной было эффективным. Общее количество лимфоцитов увеличилось до нормального показателя, а активность аденозиндезаминазы в Т-лимфоцитах увеличилась до 25% нормы.


Из стерильного бокса девочку перевезли домой. В-третьих, в течение 6 мес перед очередным курсом лечения число генноинженерных лимфоцитов и активность фермента в клетках оставались постоянными.

Выбор болезни для начала использования генотерапии был хорошо продуман. Ген аденозиндезаминазы к этому времени был клонирован, имел средние размеры и хорошо встраивался в ретровирусные векторы. Ранее во время трансплантации костного мозга при недостаточности аденозиндезаминазы было показано, что ключевую роль в развитии заболевания играют Т-лимфоциты. Следовательно, генотерапия должна быть направлена на эти клетки-мишени. Важным моментом стало то, что функционирование иммунной системы возможно при активности фермента, составляющей 5-10% контрольного показателя. Наконец, генноинженерные Т-лимфоциты имели селективное преимущество перед исходными дефектными клетками. В настоящее время около 50% детей с недостаточностью аденозиндезаминазы лечат с помощью генотерапии.

Семейная гиперхолестеринемия. Рецепторы ЛПНП, играющих ключевую роль в обмене холестерина, синтезируются в клетках печени.


В связи с этим генотерапия должна быть направлена на гепатоциты (клетки-мишени). Попытка такого лечения была предпринята в США в отношении женщины в возрасте 29 лет с резко выраженным атеросклерозом венечных артерий. Эффект предыдущего хирургического шунтирования уже прошел. Брат больной умер от такого же заболевания, не дожив до возраста 30 лет.

Генотерапия была проведена в несколько этапов. Больной была сделана частичная (около 15%) гепатэктомия . Удаленную долю печени промыли раствором коллагеназы для разделения гепатоцитов, при этом было получено около 6 млн клеток. Их выращивали в 800 культуральных чашках на питательной среде. Во время роста в культуре для включения нормального гена ЛПНП в клетки использовали ретровирусный вектор. Для того чтобы клетки достигли печени, трансгенные гепатоциты были собраны и введены пациентке через катетер в воротную вену. Через несколько месяцев при биопсии печени обнаружили, что в некоторых клетках функционирует новый ген. Содержание ЛПНП в крови снизилось на 15-30%. Улучшение состояния больной позволило проводить лечение только лекарственными средствами, снижающими концентрацию холестерина.

Гемофилия А. Опубликованы результаты лечения шести пациентов с гемофилией. От каждого больного была получена и выращена культура кожных фибробластов, которую затем трансфицировали плазмидой, содержащей последовательность гена, кодирующего фактор VIII. Клетки, продуцирующие его, были отобраны, клонированы, размножены и путем лапароскопической инъекции введены в сальник. Никаких осложнений у пациентов не зарегистрировано. У четырех больных на протяжении 10 мес концентрация фактора VIII была выше, чем до лечения, а хорошее состояние поддерживали при экзогенном введении уменьшенной дозы фактора. В экспериментальных работах показана возможность коррекции содержания фактора VIII после трансплантации аутологичных гематопоэтических клеток, трансфицированных генетической конструкцией с нуклеотидной последовательностью гена фактора VIII.

Рак. Необычайно быстрый прогресс в изучении генома человека и методов генной инженерии позволяет развивать генную терапию не только для моногенно наследуемых болезней, но и для таких многофакторных заболеваний, как рак. Генная терапия злокачественных новообразований уже начата, хотя на ее пути много трудностей, обусловленных необходимостью обеспечения селективности, специфичности, чувствительности и безопасности переноса генов.

В настоящее время применяют следующую стратегию генотерапии рака:
  • повышение иммуногенности опухоли путем вставки цитокиновых генов, генов, кодирующих главный комплекс гистосовместимости, и лимфоцитарных лигандов с целью создания противоопухолевых вакцин;

  • направленную доставку (векторирование) цитокинов в клетки (например, в лимфоциты, инфильтрующие опухоли), которые в пределах опухоли локально могут реализовать токсические эффекты;

  • использование опухолеспецифических пролекарственных активаторов, т.е. вставка ферментативно пролекарственно-активирующих генов, сливающихся с промоторными системами, которые реализуются через дифференциально контролируемую (идеально-опухолеспецифическую) транскрипцию;

  • введение маркирующих генов, которые могут обеспечивать обнаружение минимально оставленных после операции или разрастающихся опухолей;

  • искусственную репрессию функций генов путем вставки генов с противоположной функцией.

  • Небольшое число попыток генотерапии злокачественных опухолей сделано с введением в клетки резецированной опухоли генов ИЛ-2 или фактора некроза опухоли. Затем эти клетки вводят подкожно в область бедра. Через 3 нед удаляют регионарный лимфатический узел, располагающийся около места введения смеси трансгенных опухолевых клеток. Культивируют Т-лимфоциты, выделенные из этого узла, и размножают лимфоциты из опухоли (опухолеинфильтрирующие). Пациенту вводят общую массу лимфоцитов, что обеспечивает усиление иммунной реакции на опухолевые клетки. Так лечили пациентов со злокачественной меланомой , раком почки и запущенными злокачественными опухолями разных органов.

    Несмотря на кажущуюся перспективность разных вариантов генотерапии опухолевых заболеваний и ободряющие экспериментальные данные, результаты клинических исследований очень противоречивы и каких-либо заметных эффектов не получено. Возможно, это обусловлено началом лечения рака на очень запущенных стадиях. Как известно, существенных достижений при лечении злокачественных новообразований другими биологическими методами также нет. Исключение составляют меланомы (иммунобиологический подход) и глиобластома (генная терапия). Генотерапия рака - огромный раздел современной медицины, но прогнозировать его развитие очень трудно.

    Область генотерапии рака переживает стадию «неуклюжего подростка». Это направление еще не достигло зрелости и, вероятно, обладает большим потенциалом. В Китае уже официально разрешены к применению два генотерапевтических препарата для лечения тяжелых форм рака шеи и головы (гендицинρ и Н101ρ).


    Оцените статью: (14 голосов)
    4.07 5 14

    Cтатьи из раздела Генетика:


    Изменение экспрессии генов, как метод лечения
    Риски генной терапии
    Вернуться в раздел: Генетика / Генная терапия
    2007-2017 © Copyright ООО «МЕДКАРТА». Все права на материалы, находящиеся на сайте medkarta.com,
    охраняются в соответствии с законодательством РФ, в том числе, об авторском праве и смежных правах.