Типы нарушений, определяемых молекулярно-генетическими методами

фото Типы нарушений, определяемых молекулярно-генетическими методами
Определение точковых мутаций
Однонуклеотидные замены и небольшие делеции можно определить с помощью гибридизации образца ДНК с аллельспецифичными олигонуклеотидными пробами и проведения аллельспецифической ПЦР. Для проведения флюоресцентной ПЦР, в которой аллели будут отличаться цветом флюоресценции, можно подобрать универсальные праймеры и аллельспецифичные зонды. Если аллельспецифичные пробы подобрать стык в стык, а их концы снабдить универсальными праймерами, то можно провести простую или мультиплексную лигазозависимую амплификацию. Кроме того, в большинстве случаев с помощью компьютерного анализа последовательности ДНК можно обнаружить, что исследуемый полиморфизм изменяет последовательность, специфичную для одной из сотен известных в настоящий момент бактериальных рестриктаз. Соответственно его можно обнаружить с помощью анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, проведенного после предварительной амплификации фрагмента ДНК, содержащего полиморфизм. При организации крупного потока образцов с необходимостью анализа одних и тех же полиморфизмов масс-спектрометрию целесообразно использовать в качестве высокопроизводительного метода исследований однонуклеотидных полиморфизмов и небольших делеций.


При необходимости анализа большого количества редких полиморфизмов бывает выгоднее провести секвенирование последовательности ДНК.

Определение протяженных делеций
Протяженные делеции - одни из самых сложных мутаций не только для поиска новых, но и для определения в диагностических целях уже известных. Часто их определяют по отсутствию гибридизационного сигнала или его ослаблению в различных приложениях - от гибридизации по Саузерну до анализа цитогенетических препаратов с помощью флюоресцентных зондов.

Для клинической диагностики разрабатывают методики на основе ПЦР с оценкой сравнительной интенсивности получаемых ампликонов. Высокочувствительным и воспроизводимым методом анализа делеций, в том числе в гетерозиготном состоянии, показала себя МЛЗА. При анализе на капиллярном электрофорезе продуктов амплификации с нескольких разных локусов продемонстрирована высокая воспроизводимость относительных интенсивностей сигналов от каждого фрагмента, благодаря чему можно определять дозу гена.

Определение тандемных повторов
Для определения числа тандемных повторов в большинстве случаев достаточно проведения анализа полиморфизма длины амплифицированных фрагментов с помощью электрофореза в акриламидном геле или капиллярного электрофореза.


Реже требуется использование гибридизационных техник, таких как гибридизация по Саузерну.

Определение множества редких мутаций
При многих заболеваниях обнаружены не один-два полиморфизма, а десятки относительно редких, разбросанных по всему гену мутаций. В таких случаях стараются разработать молекулярно-генетические подходы, основанные на высокопроизводительных технологиях. На микрочипах можно расположить десятки аллельспецифичных проб, с которыми гибридизуют амплифицированный фрагмент ДНК пациента. С помощью секвенирования можно определить последовательность гена и обнаружить новые мутации. В то же время необходимо иметь в виду, что секвенирование в большинстве случаев проводят в экзонах, и оно не затрагивает такие важные части гена, как интроны, промоторы и энхансеры, где могут находиться патогенетически значимые мутации. С другой стороны, при обнаружении новых мутаций возникает вопрос об их функциональном значении: часто они могут не приводить к изменению аминокислотной последовательности, а даже если приводят к замене, это необязательно сказывается на функции белка.


Нередко прямое определение большого числа мутаций невозможно, в том числе в силу высокой стоимости такого анализа. В таких случаях используют просеивающие методы поиска мутаций - анализ полиморфизма конформации одноцепочечных молекул ДНК, гетеродуплексный анализ, градиентный денатурирующий электрофорез в геле и др. Эти методы неспецифичны и требуют перепроверки обнаруженных изменений другими способами, что превращает диагностическую процедуру в научно-исследовательскую. Это возможно только в исследовательской лаборатории, располагающей соответствующими возможностями и персоналом.

Поиск неизвестных генов, связанных с заболеванием. Косвенная ДНК-диагностика
До сих пор обсуждались методы и подходы, используемые при анализе мутаций в известных генах. В некоторых случаях, несмотря на установленную наследственную этиологию заболевания, остается неизвестной его молекулярно-генетическая основа, и, следовательно, прямая диагностика невозможна. В таких случаях необходимо проводить анализ сцепления высокополиморфных маркеров с заболеванием в больших семьях, в которых доступны образцы ДНК родственников и есть подробное клиническое описание каждого члена семьи. Благодаря тому что в настоящее время расшифрован геном человека, а в базах данных содержатся миллионы записей об индивидуальных отличиях, исследователям доступны высокоинформативные панели маркеров как на основе классических, различающихся по числу тандемных повторов полиморфизмов, так и однонуклеотидных полиморфизмов, обеспечивающих беспрецедентно плотное покрытие генома (в среднем один полиморфизм на 500-1000 нуклеотидов). Полиморфные ДНК-маркеры и интегральная карта их расположения позволяют определить и проследить в поколениях хромосому, несущую патологический ген. Необходимость выбора и анализа десятков, а иногда и сотен информативных генетических маркеров, а также построение родословной объясняет то, что анализ сцепления остается непростой процедурой. Он требует высокой квалификации сотрудников и всемерного содействия со стороны семьи. Кроме того, такое исследование продолжает оставаться дорогим (от нескольких тысяч долларов) и затратным по времени.


Оцените статью: (11 голосов)
3.64 5 11
2007-2017 © Copyright ООО «МЕДКАРТА». Все права на материалы, находящиеся на сайте medkarta.com,
охраняются в соответствии с законодательством РФ, в том числе, об авторском праве и смежных правах.