Получение и подготовка сперматозоидов для искусственного оплодотворения

Получение спермы для искусственного оплодотворения
Согласно рекомендации ВОЗ, сперму для искусственного оплодотворения получают путем мастурбации после 2-7 дней полового воздержания. При олигоспермии большее количество сперматозоидов можно получить, увеличив период воздержания и/или собрав несколько эякулятов Иногда в силу психологической блокады сперму путем мастурбации получить не удается. В таких случаях можно использовать эякулят из кондома (при естественном половом акте), если только он не покрыт спермицидным веществом. При эректильной дисфункции, связанной с поражением сегментов ThXI-LH спинного мозга, эякуляцию можно вызвать с помощью вибрации или электрического раздражения. Эти процедуры эффективны у 90% пациентов. У остальных сперматозоиды можно получить путем при аспирации из продольного разреза семявыносящего протока после надреза мошонки.

При иммунологическом мужском бесплодии или у пациентов с вязкой спермой приходится использовать специальные манипуляции. Подготовку сперматозоидов облегчает выделение спермы в 2 мл сбалансированной среды, что уменьшает не только степень агглютинации клеток, но и связывание антител с их поверхностью в процессе разжижения спермы.


В некоторых случаях склеившиеся сперматозоиды можно разделить с помощью протеолитических ферментов (химотрипсина, трипсина или папаина). Двадцатиминутное присутствие этих ферментов в суспензии сперматозоидов в безальбуминовой среде не повреждает клеток, но перед инсеминацией сперматозоиды необходимо отмыть, чтобы ферменты не помешали взаимодействию гамет.

У пациентов с ретроградной эякуляцией сперматозоиды для искусственного оплодотворения можно получать тремя разными способами.

С помощью специфических средств, таких, как альфа-адренергические (фенилпропаноламин, окседрин) или антихолинергические вещества (бромфенирамин) можно добиться антеградной эякуляции. Сперматозоиды из свежего эякулята можно извлечь с помощью катетера из мочевого пузыря. Для защиты сперматозоидов от действия мочи с ее кислой реакцией и высокой осмолярностью перед эякуляцией следует опустошить пузырь и промыть его 10 мл среды, а мочу подщелочить приемом большой дозы соды (1-4 г). Третий способ заключается в аспирации подвижных сперматозоидов из продольного разреза семя вы носящего протока.

При обструктивной азооспермии сперматозоиды берут в капилляр из протока придатка яичка ("микрохирургическая эпидидимальная аспирация сперматозоидов", MESA).


Сразу обнаружить подвижные клетки обычно не удается; приходится производить несколько надрезов придатка, начиная с дистального отдела его хвоста. В большинстве случаев длительной обструктивной азооспермии подвижные сперматозоиды обнаруживаются не в хвосте, а в более проксимальной части придатка. Количество сперматозоидов, получаемых таким образом, различно, но на долю подвижных клеток обычно приходится менее 20%. Эту трудоемкую процедуру можно производить за день до получения яйцеклеток. В настоящее время предпочитают получать сперматозоиды из самого яичка, а не из его придатка, поскольку это занимает гораздо меньше времени и обходится дешевле. Результаты гель-электрофореза показывают, что ДНК сперматозоидов из яичек более стабильна, чем ДНК клеток из придатков, но сравнение обоих методов в проспективных клинических исследованиях пока не проводилось.

Сперматозоиды для ИКСИ также можно получать не только из семявыносящих протоков и придатков, но и из самих яичек ("тестикулярная экстракция сперматозоидов", TESE). Чтобы найти пригодные для ИКСИ жизнеспособные клетки, приходиться брать от одной (при обструктивной азооспермии) до девяти (при гипергонадотропной азооспермии) проб ткани.


Очаги сперматогенеза могут сохраняться в отдельных семенных канальцах, даже при выраженной атрофии яичек с резким повышением уровня ФСГ в сыворотке. Жизнеспособные сперматозоиды идентифицируют по их подвижности в поле инвертированного микроскопа при 200-400-кратном увеличении и выделяют из ткани с помощью микропипетки. Чтобы экстрагировать из соединительной ткани один жизнеспособный сперматозоид, биоптат измельчают механически или обрабатывают ферментами (коллагеназой и трипсином). Биопсию и обработку ткани лучше производить за день до получения яйцеклеток, оставляя ее на ночь в культуре. Оплодотворение, имплантация и даже беременность происходят значительно чаще, если к культуре ткани яичек добавляют 25 МЕ/л рекомбинантного ФСГ. Иногда в измельченном биоптате яичка трудно обнаружить отдельный сперматозоид; поэтому недавно был предложен альтернативный метод — выделение зародышевых клеток из замороженных и оттаявших биоптатов яичка, обработанных коллагеназой.

Пациентов необходимо предупредить, что в 40-50% случаев сперматозоиды в биоптатах не обнаруживаются. Вероятность присутствия жизнеспособных клеток легко предсказать на основании результатов детального гистологического исследования биоптатов.


Чтобы избежать ненужной стимуляции яичников у женщины перед получением яйцеклеток, разработан метод крио-TESE. При этом несколько биопсий обоих яичек производят до какого-либо вмешательства в организм женщины. По одному биоптату каждого яичка исследуют гистологически, отмечая присутствие или отсутствие сперматозоидов. Два биоптата обрабатывают механически или ферментативно, а остальные замораживают.

При гистологическом исследовании сперматозоиды удается найти в 76,9% биоптатов. Прогноз присутствия сперматозоидов в замороженных и оттаявших биоптатах (основанный на обнаружении очагов активного сперматогенеза в отдельных канальцах], оказывается ошибочным только в 2,9% случаев. В 0,7% всех биоптатов находили рак яичка или карциному in situ. Частота оплодотворения, имплантации и беременности при ИКСИ не зависит оттого, используются ли для получения сперматозоидов свежие или криоконсервированные биоптаты.

Описаны также методы получения сперматозоидов путем простой чрескожной пункции эпидидимального протока ("чрескожная эпидидимальная аспирация сперматозоидов", ЧКЭАС) или самих яичек ("тонкоигольная тестикулярная аспирация сперматозоидов", ТИТАС) с последующей аспирацией клеток шприцом. Эти процедуры производятся быстро и не требуют дорогого оборудования, необходимого для MESA или TESE. Путем ЧКЭАС или ТИТАС обычно удается извлечь меньше сперматозоидов, чем с помощью более инвазивных приемов. Проспективные рандомизированные исследования, в которых сравнивалась бы клиническая эффективность предложенных методов, в настоящее время отсутствуют.

Подготовка сперматозоидов для искусственного оплодотворения
Прежде чем начать обработку пробы спермы, следует дождаться ее разжижения, которое требует простой 30-минутной инкубации при комнатной температуре.

Затем сперматозоиды необходимо отмыть, так как семенная плазма, даже в небольших количествах, может быть токсичной как для них, так и для яйцеклеток. Кроме того, в сперме могут присутствовать бактерии, которые при попадании в женские половые пути или даже при инсеминации in vitro способны пролиферировать и вызывать воспаление. Семенная плазма содержит большое количество простагландинов, которые при попадании в полость матки могут вызывать пароксизмальные и болезненные сокращения миометрия. Обработка спермы предполагает не только отделение сперматозоидов от семенной плазмы, но и увеличение доли клеток, обладающих высокой подвижностью и нормальным строением, а также индукцию процесса капацитации. Недавно были предложены методы отбора сперматозоидов с определенными генетическими особенностями (например, содержащих только Хили только Y-хромосому), что позволяет предотвратить заболевания, сцепленные с половыми хромосомами.

Различные методы подготовки сперматозоидов можно разделить на четыре группы в соответствии с используемыми физическими принципами:
• фильтрация;
• флотация;
• центрифугирование в градиенте плотности;
• проточная цитометрия.

Большинство методов включает начальное разжижение спермы (в условиях простой инкубации) и последующее отделение содержащей сперматозоиды

фракции от семенной плазмы путем центрифугирования. Супернатант выбрасывают, а дальше применяют одну из перечисленных процедур Фильтрация сперматозоидов на колонке со стеклянной ватой или стеклянными гранулами получила широкое распространение. Суспензию сперматозоидов, освобожденных от семенной плазмы, наносят на вертикальную колонку, заполненную либо 15 мг стеклянной ваты (112-го размера микроволокон), либо 1 г стеклянных гранул (диаметром 75-150 мкм каждый). Перед нанесением суспензии сперматозоидов колонку промывают культуральной средой, чтобы удалить потенциально токсические вещества и уравновесить ее содержимое. Суспензия сперматозоидов стекает вниз, и фракцию высокоподвижных клеток можно собрать по каплям и использовать для искусственного оплодотворения. Неподвижные сперматозоиды, лейкоциты и круглые клетки обычно прилипают к стеклу или задерживаются на фильтре, тогда как подвижные клетки легко проходят через колонку.

Фильтрация обеспечивает быстрый и высокий выход подвижных сперматозоидов. В этом отношении она не менее эффективна, чем флотация или центрифугирование в градиенте плотности. В процессе фильтрации теряется, по-видимому, не много клеток, а сама процедура непродолжительна (10 мин). При ЭКО отфильтрованные сперматозоиды столь же эффективны, что и клетки, полученные путем флотации.

Основной недостаток метода фильтрации (особенно при использовании стеклянной ваты) — непостоянство расстояний между волокнами и в силу этого вариабельность результатов.

Флотация
Сперматозоиды для искусственного оплодотворения чаще всего получают методом флотации, который основан на том, что самые подвижные и полноценные клетки обладают способностью всплывать против силы тяжести в верхний слой культуральной среды. Фракцию высокоподвижных сперматозоидов, не содержащую ни семенной плазы, ни лейкоцитов, можно собрать через 60-90 мин. Значение этого метода тем более велико, что для проникновения сперматозоидов в суПернатант клеткам необходимы те же свойства, что и ДОя проникновения в шеечную слизь и оплодотвореНИя яйцеклеток. Поэтому результаты искусственного оплодотворения коррелируют с концентрацией всплывших сперматозоидов. Вопреки прежним сообщениям, метод флотации не гарантирует отбора клеток, содержащих только Y-хромосому.

Основной недостаток этого метода — малый выход подвижных сперматозоидов, особенно при выраженной патологии спермы. Выход клеток можно повысить путем увеличения времени инкубации, легкого встряхивания пробирки с культурой клеток и использования сразу нескольких параллельных проб (так называемая "многопробирочный способ").

Тем не менее методом флотации можно получить более подвижные сперматозоиды и относительно большее количество нормальных клеток, чем методами центрифугирования в градиенте плотности и фильтрации. Согласно данным одного проспективного контролируемого исследования, результаты ЭКО практически не зависят от метода обработки сперматозоидов. Хотя метод флотации требует относительно больших затрат времени, он технически прост, не нуждается в сложном лабораторном оборудовании и в руках разных лаборантов дает одинаковые результаты.

Центрифугирование в градиенте плотности
Этим методом подвижные и нормальные сперматозоиды отделяются не только за счет скорости вращения центрифуги, но и в силу своего удельного веса. Известно, что жизнеспособные сперматозоиды по удельному весу отличаются от дегенерировавших или мертвых. Промытую суспензию сперматозоидов наносят на колонку, содержащую несколько слоев коллоидной жидкости разной плотности и затем центрифугируют. Для этой цели можно использовать перколл с коллоидными силиконовыми частицами диаметром 15-30 нм. Частицы покрывают биологически инертным поливинилпирролидоном (Уппсала, Швеция).

Центрифугирование в градиенте плотности отделяет живые сперматозоиды не только от мертвых, но и от лейкоцитов. Предложены различные модификации и составы растворов, содержащих коллоидные частицы: непрерывные градиенты плотности, ступенчатые градиенты плотности и ступенчатые градиенты плотности в малом объеме. Непрерывный градиент плотности требует ультрацентрифугирования (> 100 ООО д), которое лучше разделяет частицы небольшого размера, такие, как вирусы и митохондрии. Поэтому для разделения сперматозоидов, имеющих относительно крупные размеры, используют преимущественно ступенчатый градиент плотности. Фракция, обогащенная подвижными сперматозоидами, легко выявляется в виде мутной полосы в области между 85% и 100% суспензией перколла. При очень плохом качестве сперматозоидов и очень малом их количестве целесообразно использовать мини-колонку с перколлом, так как для этого требуется всего 0,9 мл жидкости.

Выход подвижных сперматозоидов при центрифугировании в градиенте плотности больше, чем при использовании метода флотации, но данные о влиянии того или иного из этих методов на результаты обычного ЭКО противоречивы. В контролируемом проспективном исследовании не было обнаружено разницы в частоте оплодотворения при использовании разных методов обработки сперматозоидов. Однако, по данным другого контролируемого исследования, частота оплодотворения после центрифугирования сперматозоидов в градиенте плотности оказалась гораздо большей, чем после флотации. В любом случае результаты искусственного оплодотворения больше зависят от состояния фертильности обоих партнеров, чем от методов обработки сперматозоидов.

Центрифугирование в градиенте плотности требует меньше времени (20 мин), чем метод флотации (минимум 60 мин) и не выделяет сперматозоиды, содержащие преимущественно Y-хромосому. Нет никакого риска и воспаления женских половых путей вследствие попадания в них коллоидных силиконовых частиц при инсеминации. Перколл может быть загрязнен эндотоксинами, но в настоящее время существуют и другие системы.

Отбор сперматозоидов с помощью проточной цитометрии
Одновременно с преимплантационной диагностикой все больший интерес привлекает возможность профилактики наследственных заболеваний путем отбора сперматозоидов с определенными генетическими свойствами. Первый этап сводится к выделению сперматозоидов с Y-хромосомой, позволяющему предотвратить сцепленные с Х-хромосомой болезни еще до оплодотворения. В ряде случаев причиной повторных выкидышей служит аномально большое количество диплоидных сперматозоидов. В этой ситуации разделение диплоидных и гаплоидных клеток перед инсеминацией и оплодотворением должно предотвратить аборт. Такое разделение осуществляют с помощью проточной цитометрии и отбора сперматозоидов, предварительно меченных флуоресцентным красителем, что позволяет различить клетки с разным количеством ДНК в геноме. Так, содержание ДНК в сперматозоидах с Х-хромосомой примерно на 3% больше, чем в клетках с Y-xpoмосомой.

Проточная цитометрия дает возможность достаточно быстро собрать то количество сперматозоидов, которое необходимо для искусственного оплодотворения. С помощью этого метода (используемого главным образом для предотвращения сцепленных с Х-хромосомой генетических заболеваний) удавалось индуцировать беременности путем ВМО, обычного ЭКО и ИКСИ. Хотя применение данного метода сопряжено с влиянием на пол ребенка, в ближайшем будущем он может приобрести важнейшее значение для профилактики врожденных заболеваний. Результаты многочисленных опытов на животных свидетельствуют о том, что флуоресцентные красители не повреждают структуру ДНК.

Обработка сперматозоидов для ИКСИ
При резко выраженной олиго-астено-терато-зооспермии или при получении сперматозоидов из придатка яичка (MESA) для обработки этих клеток можно использовать градиент плотности в малом объеме, например, мини-перколл. Зачастую для ИКСИ удается получить лишь отдельные подвижные сперматозоиды без надежного их отбора. В этих случаях для очистки пробы от примесей достаточно просто промыть осадок после центрифугирования, удалить супернатант и вновь приготовить суспензию сперматозоидов в среде.

Чтобы облегчить захват подвижного сперматозоида микропипеткой, вязкость среды можно увеличить, добавив в нее большое количество биологически инертного поливинилпирролидона (8 г/100 мл среды) с мол. массой 360 тыс. кДа. Это соединение при его возможном попадании в яйцеклетка не обладает каким-либо мутагенным действием.

Для ИКСИ можно использовать и неподвижные, но жизнеспособные сперматозоиды. Жизнеспособность таких клеток оценивают по набуханию в гипоосмотической среде. Сперматозоиды инкубируют в культуральной среде, заранее разведенной равным объемом дистиллированной воды. Живые клетки реагируют при этом типичным набуханием хвоста. Перед ИКСИ их переносят микропипеткой в исходную среду, где они восстанавливают свой объем.

Обработка сперматозоидов в культуре
Результаты искусственного оплодотворения улучшает не только отбор полноценных сперматозоидов, но и модификация состава культуральной среды.

Для стимуляции подвижности клеток в среду добавляют различные химические вещества: 2-дезоксиаденозин, пентоксифиллин и кофеин. Эти вещества ингибируют фосфодиэстеразу, приводя к увеличению внутриклеточной концентрации цАМФ. После добавления любого из них к семенной плазме или к среде подвижность, скорость и степень гиперактивации сперматозоидов значительно возрастают, но, несмотря на отчетливые изменения подвижности клеток, частота оплодотворения и беременностей не увеличивается. Кроме того, по крайней мере для кофеина, показана дозозависимая эмбриотоксичность.

Функцию сперматозоидов можно повысить не только добавлением определенных химических веществ, но и совместным культивированием с эпителиальными клетками. Действительно, у животных разных видов на функцию сперматозоидов влияет прямой контакт с клетками слизистой маточной трубы.

Экспериментальные данные свидетельствуют о возрастании подвижности и степени гиперактивации сперматозоидов при их совместном культивировании с различными клетками. Влияние совместного культивирования сперматозоидов с другими клетками на результаты искусственного оплодотворения пока не установлено. При обычном ЭКО сперматозоиды в течение ночи остаются в контакте с клетками яйценосного бугорка и радиальной короны, что может имитировать положительный эффект совместного культивирования.


Оцените статью: (13 голосов)
4.15 5 13
2007-2017 © Copyright ООО «МЕДКАРТА». Все права на материалы, находящиеся на сайте medkarta.com,
охраняются в соответствии с законодательством РФ, в том числе, об авторском праве и смежных правах.