Участие пептидов в регуляции активности хроматина и образовании свободных радикалов

фото Участие пептидов в регуляции активности хроматина и образовании свободных радикалов
Поскольку митохондриальная ДНК кодирует в основном полипептиды дыхательной цепи и не содержит информации об известных репарационных белках, на протяжении долгого времени считали, что репарация повреждений в митохондриальной ДНК невозможна. Единственной альтернативой традиционного лечения митохондриальных цитопатий являлась потенциальная возможность генетической модификации утраченных митохондриальных функций. Однако более глубокие исследования, проведенные Bohr et al. в лаборатории молекулярной геронтологии и генетики Национального института старения (Балтимор, США) показали, что в митохондриальных экстрактах могут быть обнаружены многие из известных ферментов репарации ядерной ДНК (ДНК-фосфорилаза, этилгуанин-трансфераза, метилтрансфераза, урацил-ДНК-гликозилаза, 8-оксогуанозин-эндонуклеаза класса I, эндонуклеаза класса II, dRP-миазная активность).

Для установления механизма репарации митохондриальной ДНК плазмиду, содержащую известные дефекты оснований, обрабатывали митохондриальными экстрактами, выделенными как из тканей крыс, так и из тканей человека. Было показано, что репарация возможна, но процесс носит комплексный характер и требует участия нескольких репарационных ферментов, экспрессируемых ядерной ДНК. Так, для удаления 8-oxo-dG путем замены основания требуется участие фермента оксигуанозин-ДНК-гликозилазы. Клетки с удаленным геном этого фермента не могут участвовать в репарации митохондриальной ДНК и к окончанию жизненного цикла содержат в 20 раз большее количество 8-oxo-dG, чем митохондриальная ДНК клеток дикого типа.


Вышеупомянутые факты свидетельствуют о том, что модуляция экспрессии репарационных ферментов ядерной ДНК под действием каких-либо внешних сигналов может оказывать влияние на восстановление поврежденного митохондриального генома и затем — на образование свободных радикалов в клетке. В наших предыдущих исследованиях было показано, что короткие пептиды тимуса и эпифиза могут принимать участие в регуляции генетической активности клеток. Это явилось предпосылкой для изучения влияния мелатонина, эпиталамина и синтетических пептидов вилона и эпиталона на свободнорадикальные процессы у человека и животных.

Как было показано ранее, уровень образования свободных радикалов и их обезвреживания неодинаков для разных органов. Наиболее интенсивное образование активных форм кислорода наблюдается в сыворотке крови, где оно более чем в 2 раза превышает соответствующие показатели в печени и мозге. При этом уровень общей антиоксидантной активности в сыворотке крови значительно ниже по сравнению с таковым в печени и мозге. Введение вилона не оказало сколько-нибудь существенного влияния ни на один из изученных показателей. Введение эпиталона эффективно угнетало образование активных форм кислорода в ткани мозга. Закономерно с этим в присутствии эпиталона ослаблялся процесс перекисного окисления липидов. Причем в головном мозге действие эпиталона было направлено преимущественно на конечные этапы этого процесса (основания Шиффа), а в печени — в основном на начальные этапы (диеновые конъюгаты).


Введение мелатонина приводило к достоверному повышению общей антиокислительной активности в сыворотке крови мышей и угнетало оба этапа перекисного окисления липидов в печени и головном мозге.

Как было отмечено ранее, наиболее интенсивное образование активных форм кислорода, в том числе при старении организма, наблюдается в сыворотке крови. Были проведены дополнительные исследования влияния мелатонина и комплекса пептидов эпифиза (эпитала-мин) на показатели свободнорадикальных процессов в сыворотке крови крыс. Эпиталамин вводили 2-3-месячным крысам в течение 5 дней в утренние часы подкожно в дозе 0,5 мг на животное. Мелато-нин давали с питьевой водой (20 мг/л). При введении эпиталамина существенно снижается интенсивность перекисной хемилюминесценции в сыворотке крови (в 3,4 раза) и перекисного окисления липидов. Это выражается в значительном снижении содержания диеновых конъюгатов (в 4,1 раза), тогда как содержание оснований Шиффа имело лишь тенденцию к снижению. Уровень пероксидации белков сыворотки крови не претерпевал заметных изменений при воздействии эпиталамина. Мелатонин также снижал интенсивность перекисного окисления липидов — в сыворотке крови снижался уровень диеновых конъюгатов и оснований Шиффа.

Следует отметить, что при введении мелатонина содержание карбонильных производных аминокислот в белках несколько увеличивалось. Введение как эпиталамина, так и мелатонина сопровождается существенным увеличением общей антиокислительной активности (на 35%).


Наши наблюдения свидетельствуют о том, что эпиталамин и мелатонин способствуют снижению выработки свободных радикалов в клетке, защищают белки и липиды от перекисного окисления и, таким образом, способствуют поддержанию структурно-функциональной целостности клетки и ее резистентности к внешним неблагоприятным воздействиям. Следует подчеркнуть, что исследованные нами гормональные продукты эпифиза (эпиталамин, мелатонин), а также синтетические пептиды (вилон и эпиталон) обладают выраженной общей антиокислительной активностью, однако механизм их действия, вероятно, неодинаков и имеет комплексный характер. Мелатонин и пептиды эпифиза могут оказывать влияние как на функционирование ферментов антиоксидантной системы клетки, так и на выработку в ней свободных радикалов. В дальнейших экспериментах с плодовыми мушками Drosophila melanogaster мы исследовали возможное участие пептидов в регуляции выработки свободных радикалов в митохондриях на протяжении жизни организма.

Введение в питательную среду эпиталона повышает активность ферментов антиоксидантной защиты у Drosophila melanogaster и ослабляет интенсивность перекисного окисления липидов на протяжении всей жизни имаго. Нами проведено исследование влияния пептидов эпиталона и вилона на генерацию активных форм кислорода в субклеточных фракциях D melanogaster линии НА+. Для этого эпиталон и вилоп, растворенные в физиологическом растворе, добавляли в питательную среду в количестве 0,00001 % от массы среды, воздействуя на личинок 2-3-дневного возраста.


Таким образом, длительность действия не превышала 2 суток. Митохондрии выделяли из имаго 10 и 25 суток, т. е. из мух молодого и зрелого возраста. Оставшийся после отделения митохондриальных и ядерных фракций суммарный препарат (цитозоль) содержал микросомы и растворимую часть клеток. Цитозоль использовали для определения количества свободных радикалов, вырабатывающихся вне митохондрий. Генерацию активных форм кислорода в организме самцов и самок определяли отдельно. Представленные ранее данные литературы подчеркивают важную роль митохондрий в процессе генерации свободных радикалов и изменении этого показателя на протяжении жизненного цикла организма. Действительно, полученные нами результаты убедительно показывают, что содержание активных форм кислорода в митохондриях как молодых, так и взрослых особей на порядок превышает их содержание в цитозоле.

Кроме того, уровень образования активных форм кислорода в митохондриях самцов во всех вариантах опытов был в среднем в 2 раза выше, чем у самок. Эти результаты согласуются с нашими данными о том, что средняя продолжительность жизни самцов этой линии составляет 22 дня, а самок — 30 дней. Возраст самок к моменту измерения был меньше средней продолжительности жизни, а возраст самцов превысил ее. Вероятно, у самцов в исследованный период времени уже началось возрастное снижение активности системы антиоксидантной защиты, что отразилось на увеличении уровня активных форм кислорода, продуцируемых митохондриями. При исследовании влияния пептидов на процесс выработки свободных радикалов в митохондриях было показано, что достоверное снижение образования активных форм кислорода наблюдается только у самок при действии вилона.


При этом уровень генерации активных форм кислорода снижался как у молодых (в 1,7 раза), так и у зрелых особей (в 1,5 раза) по сравнению с контролем. Эпиталон не оказывал существенного влияния на процессы генерации активных радикалов. Вероятно, действие вилона, а также отдельных пептидных фракций, входящих в состав комплексного препарата эпиталамина, направлено на поддержание функционального состояния белков-переносчиков в дыхательной цепи, в то время как эпиталон в большей степени способствует увеличению активности ферментов антиоксидантной защиты клетки.

Известно, что сердце является органом, характеризующимся высоким уровнем энергообмена, сопряженным с дыханием. Клетки мышечных тканей сердца содержат большое количество митохондрий. Для установления возможного участия пептидов в регуляции функциональной активности дыхательной цепи митохондрий определяли влияние, которое оказывают вилон, тимоген и эпиталон на экспрессию генов, представленных в сердце. Пептидные препараты вводили в виде подкожных инъекций здоровым взрослым мышам линии СБА. Животные контрольной группы получали подкожные инъекции физиологического раствора. Относительные уровни экспрессии генов в сердцах животных контрольной и экспериментальных групп измерялись методом гибридизации меченных радиоактивным изотопом фосфора проб кДНК, приготовленных из общей РНК сердец с микро-арреем в составе 15,247 клонов из состава комплекта, принадлежащего Национальному институту старения США. Необходимо отметить, что протестированные пептиды вилон, тимоген и эпиталон способны влиять на экспрессию ядерных и митохондриальных генов, представленных в сердце здоровых взрослых мышей. Под действием пептидов изменялась экспрессия 1,25—1,74% всех генов как в сторону увеличения (до 6,61 раза по сравнению с контролем), так и в сторону уменьшения (до 3,06 раза по сравнению с контролем). Среди генов, экспрессия которых менялась при введении в организм пептидов, отмечены группы, ответственные за клеточную структуру и подвижность; гены, кодирующие пептиды защитных систем клетки; группа генов восприятия клеточных сигнальных систем и систем коммуникации. Особую группу генов, реагирующих на воздействие исследованных пептидов, составляют гены экспрессии регуляторных белков, гены регуляции метаболизма и клеточного деления. В ходе более подробного рассмотрения изменений, присущих экспрессии митохондриального генома под действием исследованных пептидов и мелатонина, было выявлено, что пептиды изменяют более чем в 2 раза уровень таких митохондриальных генов, как 16 S, НАДН-дегидрогеназы 1, цитохром С оксидазы 1, НАДН-дегидрогеназы 4, НАДН-дегидрогеназы 5, цитохром В.

До настоящего момента не установлено, есть ли непосредственное взаимодействие исследуемых пептидов с ядерной или митохондриальной ДНК. Вероятнее всего, пептиды эпифиза (синтетические и природные), как и большинство пептидных гормонов и других внешних сигналов нелипофильной, природы реализуют свое регуляторное действие через универсальный для эукариот мембранно-внутриклеточный механизм. Такой механизм регуляции обмена веществ характерен для веществ, не проникающих через клеточную мембрану, и опосредован действием вторичных медиаторов (мессенджеров) — циклических нуклеотидов цАМФ, цГМФ, ионов Са2+, церамидом и фосфорилхолином. Известно, например, что действие таких тканевых регуляторов деления клетки, как кейлоны и интерферон, опосредовано действием цАМФ, в то время как действие фитогемагглютининов и факторов роста нервов — цГМФ и Са2+. Установлено, что в процессе передачи внешнего сигнала от пептидов вилона, тимогена и эпиталона к ядерной ДНК задействованы по крайней мере три клеточные системы вторичных мессенджеров: аденилат- (гуанилат-) циклазная (тимоген) и сфингомиелиновая (вилон, эпиталон). В данной регуляторной системе пептиды (как нестероидные гормоны или любые другие внеклеточные регуляторы) связываются с рецепторами на поверхности клетки и активируют аденилат(гуанилат)-циклазу или нейтральную сфингомиелазу. Образовавшиеся при этом вторичные мессенджеры осуществляют свое действие через соответствующие протеинкиназы (ферменты, катализирующие реакции фосфорилирования), а протеинкиназы на последующих этапах регулируют уровень фосфорилирования гистонов, негистоновых белков хроматина (НГБ) или активируют другие системы модификации ядерных белков, в том числе метилирование и ацетилирование гистонов.

Далее, в результате физико-химических изменений, возникающих либо в гистоновом октамере, либо в молекуле ДНК, происходит ослабление силы взаимодействия между ДНК и гистонами и разворачивание минимальной нуклеосомы (структурной единицы хроматина). ДНК, свободная от гистонов, становится доступной для считывания информации ферментами транскрипции. Происходит белковый синтез. Таким образом регулируется матричная активность хроматина. По всей видимости, на первых этапах регуляции активности хроматина исследуемые нами пептиды продуцируют выработку других регуляторных ядерных белков и пептидов. Так, при действии вилона и эпиталона в клетках сердца наблюдали усиление экспрессии многих известных регуляторных негистоновых белков хроматина (убиквитина, убиквитиноподобного белка SUMO-1, Вох-белков, белков цинкового пальца ZNF01, HUMORFKG1B, Zfp61) и связанных с их функционированием систем (убиквитин-коньюгирующий фермент системы убиквитин-зависимого протеолиза, протеиназы, пары циклин-циклинзависимых киназ).

Перечисленные негистоновые белки хроматина осуществляют контроль клеточного цикла и стимулируют синтез белков в ответ на внешние воздействия, в том числе белков и ферментов, участвующих в репарации ДНК. Известно, что транскрипционно-активный хроматин содержит повышенное количество убиквитина, ковалентно связанного с гистоном Н2А. Убиквитин отщепляется от гистонов во время митоза и коньюгирует снова при репликации хроматина. Кроме того, убиквитин обеспечивает быстрое расщепление связанных с ним белков на протеосомах (убиквитин-зависимый протеолиз). Эта про-теолитическая система является частью механизма регуляции клеточного цикла посредством активации убиквитин-зависимого протеолиза многих факторов активации транскрипции, таких как циклины и транскрипционный фактор Мус. Недавно обнаружено, что есть взаимосвязь между убиквитин-зависимым протеолизом и процессами мутагенеза и репарации ДНК. В частности, убиквитин-конъюгирующий ферментный комплекс принимает участие в пострепликационной репарации ДНК и обеспечивает защиту ДНК от внешних повреждений в различных денатурирующих условиях. В отличие от убиквитина группа убиквитиноподобных белков, к которым относится SUMO-1, регулирует переход клеток из фазы G2 в фазу митоза посредством контроля размера теломеров и процесса сегрегации хромосом.

Хорошо известно, что функционирование митохондрий и репарация митохондриальной ДНК невозможны без импорта белков, кодируемых ядерным геномом. Ферменты репарации ядерной ДНК синтезируются в цитоплазме и с помощью белков-переносчиков митохондриальной мембраны транспортируются в матрикс митохондрий. Вероятно, так регулируется репаративная и транскрипционная активность митохондриальных генов под действием таких исследованных пептидов, как вилон, тимоген и эпиталон. Усиление общей экспрессии митохондриальных генов имеет очень большое значение для стареющего организма, так как большинство митохондриальных дисфункций сопряжены с заниженным уровнем транскрипции митохондриальной ДНК, недостаточным белковым синтезом и ослабленным митохондриальным дыханием (продукцией энергии). Кроме того, в основании большинства возрастных митохондриальных болезней лежат мутации в одном или двух генах митохондриальной ДНК, которые кодируют субъединицы дыхательной цепи.

В этом случае репарация дефектов генов и восстановление функций мембранных белков уменьшают риск возникновения и развития митохондриальных цитопатий. Исследованные пептиды вилон, тимоген и эпиталон усиливают экспрессию генов дыхательной цепи митохондрий и особенно субъединиц ND4 и ND5 НАДН-дегидрогеназы, что является перспективным для терапии нейродегенаративных старческих заболеваний, связанных с мутациями в этих генах, в том числе острой энцефалопатии, лейкодистрофии, миоклональной эпилепсии, болезни Паркинсона и болезни Альцгеймера. Резюмируя представленный обзор данных, следует подчеркнуть, что процессы свободнорадикального окисления играют существенную роль в механизмах старения и развитии возрастной патологии. Применение пептидов для восстановления нарушений пептидергической регуляции гомеостаза имеет важное значение при лечении и профилактике возрастной патологии.


Оцените статью: (12 голосов)
4 5 12
2007-2017 © Copyright ООО «МЕДКАРТА». Все права на материалы, находящиеся на сайте medkarta.com,
охраняются в соответствии с законодательством РФ, в том числе, об авторском праве и смежных правах.