Методологические комментарии

фото Методологические комментарии
Эксперименты выполнены на крысах-самцах линии Вистар массой 180-200 г, которых содержали в виварии в обычных условиях при естественном освещении и сбалансированном рационе. Животных разделили на шесть групп: 1 и 1а — контрольные группы (интактные крысы); 2 и 2а — облученные животные; 3 и За — облученные животные, которым вводили эпиталон. Параметры радиационного воздействия для моделирования преждевременного (ускоренного старения) представлены ниже. Через 24 часа после начала облучения животным групп 3 и За вводили эпиталон по 0,5 мкг в 0,5 мл физиологического раствора подкожно отдельным инсулиновым шприцем и в последующие 9 дней инъекции повторяли. Животным групп 2 и 2а вводили равное количество физиологического раствора. Забой животных и взятие проб тканей производили под нембуталовым наркозом (50 мг/кг) с 10 до 12 часов при естественном освещении. Животных групп 1, 2, 3 умерщвляли на 14-е сутки после облучения, животных групп 1а, 2а и За — на 21-е сутки после облучения.

Для моделирования преждевременного (ускоренного) старения использовали гамма-облучение животных на аппарате ЛУЧ-1 (источник бОСо; мощность дозы 17,166x10 4 Гр/с). Ежедневную дозу в 1,25 Гр животные групп 2, 2а, 3 и За получали в течение 5 последовательных дней. Кусочки органов фиксировали в течение 24 часов в кислой жидкости Буэна для свето-микроскопических исследований и по Карновскому для электронной микроскопии. По общепринятым методикам производили обезвоживание материала и заливку его в парафин для световой микроскопии и в смесь эпонов для ультраструктурных исследований. Парафиновые срезы толщиной в 7 мкм помещали на предметные стекла, покрытые пленкой из пол и-L-лизина (Sigma).


Ультратонкие срезы толщиной в 100 нм приготавливали на ультрамикротоме LKB-7A (LKB), после чего контрастировали уранил-ацетатом и цитратом свинца. С помощью микроскопа Jenamed-2 (Zeizz) проводили общегистологическое и иммуногистохимическое изучение. На электронном микроскопе JEM-100S (JEOL) производили электронно-микроскопическое исследование.

Окраску гематоксилином-эозином и но Ван-Гизону использовали для обзорного исследования. Тучные клетки избирательно окрашивали 1%-ным раствором толуидинового синего (Fluka). Методом ШИК в аденогипофизе выявляли гликопротеиды. По методу Севки определяли биогенные амины в надпочечниках. С помощью мышиных моноклональных антител к PCNA (клон PC 10, Calbiochem, титр 1:50) изучали пролиферативную активность клеток. АБП-набором для выявления мышиных иммуноглобулинов (Vectastain) идентифицировали моноклональные антитела. Для исследования С-клеток щитовидной железы применяли моноклональные антитела к калыштонину (Dako, 1:100).

Согласно основным требованиям, предъявляемым к иммуногистохимическим методам, производили иммуногистохимическое выявление антигенов на гистологических срезах по приводимой ниже схеме.
• Срезы, предварительно в течение 10 минут прогретые в термостате при +56 °С, депарафинировали проводкой через ксилол, этанол различной концентрации и доводили до дистиллированной воды.
• Раствором перекиси водорода (3%) в течение 10 минут блокировали эндогенную пероксидазу.
• Срезы промывали ФРК, добавляя 0,25% тритона Х-100 (Sigma).
• Нормальной сывороткой животного-донора (1 %) в течение 20 минут блокировали неспецифическое связывание иммуноглобулинов вторых антител.
• Первые антитела (против выявляемого антигена) при разведении, соответствующем оптимальному иммуноокрашиванию, наносили на срезы после удаления избытка нормальной сыворотки (без промывания).


Стекла помещали во влажную камеру, после чего препараты инкубировали в холодильнике при температуре +4 °С в течение 18 часов.
• После инкубации с первыми антителами срезы промывали ФРК (3 раза по 5 минут), наносили биотинилированные антитела к иммуноглобулинам животного-донора первых антител и инкубировали соответственно инструкции, приложенной к коммерческому набору.
• Срезы промывали ФРК (3 раза по 5 минут), после чего наносили авидин-пероксидазный или стрептавидин-пероксидазный комплекс с инкубацией также согласно инструкции к коммерческому набору.
• Срезы промывали ФРК (3 раза по 5 минут), маркерный фермент (пероксидазу) в течение 10 минут проявляли в инкубационной смеси с диаминобензидином и перекисью водорода (DAB-system, Immuno-tech.)
• Препараты промывали сначала ФРК, после чего — дистиллированной водой, а затем последовательно обезвоживали в спиртах, просветляли в ксилоле и заключали в Entellan (Merck).

Методом избирательной импрегнации ядрышковых организаторов изучали функциональную активность клеток надпочечников. Количественные исследования выполняли с помощью системы компьютерного анализа микроскопических изображений (Imstar) с применением прикладных компьютерных лицензионных программ Morphostar и Colquant (Imstar) при соблюдении основных принципов морфометрии и стереологии. В аденогипофизе определяли оптическую плотность ШИК-реакции на площади 2 мм2. В тимусе тучные клетки измеряли на площади не менее 5 мм2. Индекс пролиферативной способности клеток надпочечников (IPCNA) определяли в 5 полях зрения (не менее 5000 ядер).


В 100 ядрах каждой зоны коры надпочечников и мозгового вещества анализировали площадь ядер и объемную плотность гранул AgNOR. Объемную долю норадреналин-содержащих клеток измеряли на площади более 2,5 мм2. Для анализа С-клеток в щитовидной железе использовали показатель объемной доли (рС), количественной (NC/1mm2) и оптической плотности (OpDC). Статистическую обработку данных производили с использованием t-критерия Стьюдента и ненараметрического U-критерия Манна — Уитни.


Оцените статью: (8 голосов)
4.25 5 8
2007-2017 © Copyright ООО «МЕДКАРТА». Все права на материалы, находящиеся на сайте medkarta.com,
охраняются в соответствии с законодательством РФ, в том числе, об авторском праве и смежных правах.