Методологические аспекты исследования ультраструктуры нейроэндокринных клеток в модели радиационного старения

фото Методологические аспекты исследования ультраструктуры нейроэндокринных клеток в модели радиационного старения
Общее количество животных, вовлеченных в эксперименты с общим однократным облучением и в эксперимент с пролонгированным облучением, составило 260 самцов крыс линии Вистар. При этом электронно-микроскоиические исследования проведены на 58 животных. Животные содержались в обычных условиях вивария при естественном освещении и сбалансированном рационе питания. Однократное облучение. При планировании исследований учитывалось, что у различных млекопитающих развитие кишечной фазы лучевой болезни имеет свои особенности. Средняя тканевая поглощенная доза, приводящая к гибели 50% животных в течение 30 суток после облучения (LD50/30), для крыс составляет около 7 Гр. Облучение на данном уровне LD50/30 позволяет одновременно выявить ультраструктурную дезорганизацию APUDoциtob двенадцатиперстной кишки, наблюдаемую после воздействия ионизирующей радиации в дозах летального диапазона, и в то же время получить максимальную выживаемость животных как через 6, так и через 12 месяцев, прошедших с момента общего однократного облучения.

В экспериментах было задействовано 200 самцов крыс линии Вистар массой 180-200 г, из этого количества (из числа выживших) после облучения в летальном диапазоне доз (в дозах 7 и 7,5 Гр в двух разных повторностях опыта) и интактных крыс было отобрано по 10 особей в каждой экспериментальной точке для проведения морфологических исследований эндокринных клеток двенадцатиперстной кишки через 6 и 12 месяцев после общего однократного облучения. Все животные были разделены на 4 группы: группы 1,1а — интактные крысы; группы 2,2а — крысы, подвергнутые общему однократному облучению в дозах 7 Гр и 7,5 Гр соответственно.


Общее однократное гамма-облучение животных групп 2, 2а выполнено на кобальтовом аппарате «ГУБ 20000» при мощностях дозы 1,60 и 1,77 Гр/мин соответственно.

Выделение проксимального отдела двенадцатиперстной кишки проводили утром с 10 до 12 часов при естественном освещении под нембуталовым наркозом (50 мг/кг): у животных 1-й и 2-й групп — через 6 месяцев после воздействия ионизирующей радиацией, а у животных групп 1а и 2а — через 12 месяцев после облучения. Пролонгированное облучение. В эксперимент было вовлечено 60 самцов крыс линии Вистар массой 140-160 г. Животные были разделены на 2 группы: 20 особей — интактные крысы и 40 — крысы, подвергнутые пролонгированному облучению в течение 20 дней в суммарной дозе 2,5 Гр. Такой выбор суммарной дозы ионизирующего излучения обусловлен тем, что в ранее проводимых экспериментах доза однократного острого облучения в 1 Гр не вызывала в эндокринных клетках ЖКТ животных деструктивных нарушений и массивного выброса гормонов, а начиная с 5 Гр данные ультраструктурные изменения уже надежно регистрировались. В литературе нами не было найдено данных о проведении ранее исследований ультраструктурной организации эндокринных клеток ЖКТ после воздействия пролонгированного облучения, и выбранная для наших опытов доза облучения основывалась на известном положении о том, что эффективность пролонгированного облучения обычно меньше, чем равного ему по дозе острого облучения. Можно было надеяться, что доза 2,5 Гр близка к нижней границе регистрируемого эффекта пролонгированного облучения для APUDцитов, что и подтвердили в дальнейшем результаты проведенных экспериментов.

Гамма-облучение проводилось в феврале 2001 г.


с помощью установки «Эксперимент» (источник 137Cs; мощность поглощенной дозы в прямом пучке 5,32 мГр/ч). Животные получали ежедневную дозу 0,125 Гр в течение 20 дней. Для электронно-микроскопического исследования было впоследствии отобрано по 9 крыс из облученной и интактной групп. Проксимальный отдел двенадцатиперстной кишки у животных выделяли при естественном освещении через 1 сутки после окончания эксперимента. Подготовку тканевых образцов и их ультраструктурное исследование осуществляли в следующей последовательности. Электронно-микроскопическое исследование. Извлеченный кусочек ткани проксимального отдела двенадцатиперстной кишки с помощью лезвия нарезали на кусочки размером 1 х 3 мм в капле глютаральдегида (2,5%). Для фиксации использовали смесь Карновского, состоящую из 25%-ного раствора глютаральдегида (10 мл), 40%-ного раствора формальдегида (5 мл) и 0,1 М раствора фосфатного буфера рН 7,2-7,4 (85 мл). Материал фиксировался в смеси Карновского в течение 2 часов при комнатной температуре с последующей дофиксацией в 1%-ном растворе четырехокиси осмия в течение 1 часа при комнатной температуре.

После промывки и обезвоживания в спиртах восходящей крепости образцы ткани пропитывались и заливались в смесь эпонов, состоящей из двух составных компонентов: смеси А — 62 мл эпона 812 и 100 мл DDSA (додецил-янтарный ангидрид) и смеси В — 100 мл эпона 812 и 89 мл MNA (метил-надик ангидрид). Полная смесь эпонов готовилась из 2,5 мл смеси А, 2,5 мл смеси В и 0,15 мл (4 капли) отвердителя DMP-30 (2, 4, 6 тридиметил-аминометил-фенол).


Полимеризация залитого материала проводилась в течение ночи в термостатах при 37°С и затем в течение 24 часов при 58°С. Для контроля взятия именно того участка ткани, в котором присутствуют необходимые для исследования клетки, предварительно готовили полутонкие срезы (толщиной 1 мкм) и исследовали их с помощью светового микроскопа. После этого блоки затачивали таким образом, чтобы ультратонкие срезы содержали только необходимые для исследования клетки. Для получения полутонких срезов использовали ультрамикротом LKB-7A (LKB, Швеция) и изготовитель ножей KNIF — MARKER LKB-91 (LKB, Швеция).

Полутонкие срезы наносились на предметные стекла в каплю дистиллированной воды и нагревались до полного высыхания капли и расправления среза. Затем срезы последовательно окрашивались метиленовым синим и азуром-11, что позволяло ориентировать материал для прицельной заточки. С помощью светового микроскопа в слизистом слое эпителия двенадцатиперстной кишки для прицельной заточки выбиралась преимущественно область крипт и основания ворсинок, где находится наибольшее количество эндокринных клеток двенадцатиперстной кишки. Ультратонкие срезы (толщиной 150-50 нм) готовились с помощью того же оборудования, что и полутонкие срезы, только к ножу прикреплялись специальные ванночки, наполненные дистиллированной водой, на поверхность которой срезы переходили при резке. Полученные таким образом ультратонкие срезы монтировались на «бленды» — медные сетки диаметром до 3 мм, которые имели на своей поверхности отверстия диаметром 0,01 мм, что позволяло исследовать в электронном микроскопе 8-10 полей зрения.


Для избежания деформации срезов при действии электронного луча предварительно на чистые сетки наносилась опорная пленка из раствора формвара, на которую снимались срезы с поверхности воды.

Срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу. При совместном использовании уранилацетата и цитрата свинца контрастность препарата увеличивается в значительно большей степени, чем при раздельном применении этих веществ. Для электронно-микроскопического исследования срезы на блендах контрастировались сначала 4,5%-ным раствором уранилацетата в течение 10 минут с тщательной последующей промывкой сеток дистиллированной водой, затем еще в течение 10 минут цитратом свинца по модифицированному методу Рейнольдса в присутствии едкого натра для поглощения С02, также с последующей промывкой. Электронно-микроскопические исследования проводились на электронном микроскопе JEM — 100S (JEOL, Япония) в трансмиссионном режиме. Фотосъемка тканевых и клеточных участков проводилась встроенной в микроскоп фотокамерой при автоматическом экспонировании с маркировкой на фотопленке увеличения и номера кадра. Для электронно-микроскопических исследований ультраструктуры эндокринных клеток было выбрано одинаковое увеличение микроскопа 10 500 для всех снимков для облегчения идентификации разных типов эндокринных клеток, локализованных в слизистом слое двенадцатиперстной кишки, по расположенным в их цитоплазме секреторным гранулам разной формы, плотности и размеров..




Оцените статью: (6 голосов)
4.17 5 6
2007-2017 © Copyright ООО «МЕДКАРТА». Все права на материалы, находящиеся на сайте medkarta.com,
охраняются в соответствии с законодательством РФ, в том числе, об авторском праве и смежных правах.