Методология изучения структурно-функциональной организации нейроэндокринных клеток желудка и кишечника

фото Методология изучения структурно-функциональной организации нейроэндокринных клеток желудка и кишечника
Вырабатывая различные физиологически активные вещества, клетки диффузной эндокринной системы обладают определенными общими биохимическими, цитохимическими и ультраструктурными признаками, которые отличают их от других видов клеток. Указанные свойства клеток APUD-системы послужили основой для разработки и применения комплекса чувствительных методов исследования: гистохимических и иммуногистохимических, радиоавтографии, гибридизации in sito специфических мРНК и электронной микроскопии, — способных объективно верифицировать синтезируемые продукты и изучить их метаболизм и цитохимическую патологию.

Гистохимические методы. К традиционным гистохимическим методам выявления клеток ДЭС относятся импрегнация серебром, окраска свинцовым гематоксилином и флуоресцентный анализ. Из большого числа методов импрегнации серебром наиболее часто применяют аргирофильные реакции по Гримелиусу, Севьеру — Мунгеру, Давенпорту и аргентаффинную реакцию по Массону. При этом ряд клеток обнаруживает аргирофильные свойства, т. е. они выявляются только после воздействия какого-либо восстановителя. Некоторые клетки являются аргентаффинными: они не нуждаются в постороннем восстановителе, поскольку содержат высокоактивные вещества, обладающие способностью самостоятельно восстанавливать соли серебра.


Методы импрегнации серебром достаточно просты в выполнении, дают хорошо воспроизводимые результаты и позволяют проводить морфометрические исследования для изучения поведения эндокринных клеток при патологических состояниях.

Экспериментально установлено, что положительную реакцию по Гримелиусу дает большинство известных эндокринных клеток ЖКТ, А- и РР-клетки островков поджелудочной железы, С-клетки щитовидной железы. Аргирофильные клетки также выявляются в гипофизе, в паращитовидных железах, в мозговом веществе надпочечников и параганглиях. По методу Севьера — Мунгера интенсивно импрегнируются ЕС-, ECL- и К-клетки в ЖКТ и С-клетки щитовидной железы. Модифицированный метод Давенпорта позволяет селективно выявлять D-клетки, вырабатывающие соматостатин. Аргентаффинный метод Массона в модификации Гамперля применяют для идентификации ЕС-клеток.

При импрегнации срезов вышеуказанными методиками гранулы эндокринных клеток окрашиваются в черный или темно-коричневый цвет. Кроме того, используется метод Севки, при котором ЕС-клетки окрашиваются в оранжевый цвет, ECL-клетки — в красный, А-клетки — в желто-зеленый, НА-клетки — в сине-зеленый или фиолетовый цвет.


Свинцовым гематоксилином избирательно окрашиваются А-клетки островков поджелудочной железы, ЕС-, G-, Х-клетки ЖКТ, клетки гипофиза, мозгового вещества надпочечников и каротидного тела. Как правило, эндокринные клетки, идентифицированные свинцовым гематоксилином, проявляют аргирофильные свойства при окраске по методу Гримелиуса. Для выявления внутриклеточной локализации биогенных аминов и топохимического дифференцирования катехол- и индоламинов разработаны высокочувствительные методы с обработкой ткани парами формальдегида, глиоксиловой кислоты и ортофталевого альдегида. Эти методы основаны на способности моноаминов конденсироваться с указанными соединениями и образовывать флуорофоры. Различие спектров флуоресценции продуктов конденсации позволяет дифференцировать амины. Этим методом выявляются ЕС-клетки, моноамин-содержащие клетки гипофиза и клетки мозгового вещества надпочечников. Некоторые соединения, не выявляющиеся с помощью формальдегида, N-ацетилированные индоламины (мелатонин) и метоксилированные катехоламины В-метокситирамин) можно идентифицировать методом конденсации с глиоксиловой кислотой.


Ортофталевый альдегид применяют для выявления гистамина.

Метод флуоресценции, индуцированной формальдегидом после введения диоксифениламина (ДОФА), используют для изучения способности эндокринных и некоторых неэндокринных клеток поглощать и декарбоксилизировагь экзогенно введенные предшественники биогенных аминов. Иммуногистохимия. По сравнению с классическими гистологическими и гистохимическими окрасками методы иммуногистохимии позволяют с высокой избирательностью выявлять и локализовать в тканях, клетках и внутриклеточных структурах молекулярные компоненты, обладающие антигенными свойствами. Получение моноклональных антител и иоликлональных антисывороток к продуктам жизнедеятельности эндокринных клеток, а также возможность маркировать антитела флуоресцентными красителями (флуоресцеинизотиоционатом, тетраметилродаминизотиоционатом), ферментами (перок-сидазой, щелочной фосфотазой и глюкозооксидазой) или металлами (коллоидным золотом) без изменения их иммунореактивности открыли широкие перспективы для изучения структурно-функциональной организации клеток ДЭС. При использовании антитело-ферментных конъюгаторов связанный с антителом фермент выявляют на заключительном этапе проведения реакции «антиген — антитело». Образующиеся в результате специальных гистохимических реакций полимерные красители дают интенсивно окрашенный продукт, который можно наблюдать в обычном световом микроскопе. Кроме того, продукт ферментативных реакций можно сделать электронно-плотным и использовать для выявления антигенов на ультраструктурном уровне.

Для точной идентификации эндокринных клеток и установления типа продуцируемых ими гормонов используют различные способы иммуногистохимического анализа с применением антител к активным пептидам, биогенным аминам и специфическим для данной популяции клеток белкам и ферментам, таким как хромогранины и нейроспецифическая энолаза. Методы иммуногистохимии отличаются высокой специфичностью. Однако ряд трудностей (возможность перекрестных реакций, неспецифицеская сорбция антител, необходимость сохранения в ткани изучаемого антитела без изменения его иммунореактивности и др.) требует критического рассмотрения результатов для их объективной трактовки. Радиоавтография. Методы фотодетекторной регистрации соединений, меченных радиоактивными изотопами, применяют для изучения метаболических процессов в эндокринных клетках, трансмиссии гормонов как посредников химической информации на клетки-мишени и биохимических механизмов, включенных в их реализацию.

Сочетание методов связывания высокоспецифических радиолигандов (меченых гормонов или их аналогов) с радиоавтографией позволяет визуализировать анатомическую и клеточную локализацию рецепторов к биогенным аминам и регуляторным пептидам. Радиоавтографический и иммуногистохимический анализ дает возможность изучать транспорт, депонирование, органные особенности утилизации и метаболизма экзогенно введенных гормонов. Использование меченных тритием предшественников биогенных аминов (5-окситриптофана и ДОФА) представляет определенную ценность для изучения APUD-механизма, идентификации типов APUDoциtob и оценки их функциональной активности в условиях патологии. Для решения вопроса о специфичности синтеза, а не накопления активных веществ определенными типами клеток, используют метод гибридизации «in situ», позволяющий идентифицировать мРНК, кодирующие уникальные последовательности аминокислот при синтезе белков, оценить уровень экспрессии генов этих белков и исследовать механизмы ее регуляции. В основе метода лежит регистрация меченых фрагментов ДНК и РНК, комплементарных к изучаемой мРНК.

Электронная микроскопия. В топографическом плане клетки ДЭС локализуются либо диффузно (пищеварительный тракт, мочеполовые пути), либо группами среди клеток какого-либо органа (мозговое вещество надпочечников, островки Лангерганса в поджелудочной железе). Такие морфологические признаки, как размеры и форма (округлая, треугольная, наличие островков), ультраструктура ядра, ядрышек, эндоплазматической сети, пластинчатого комплекса Гольджи, не являются достаточно специфичными для всей популяции эндокринных клеток в целом. Указанные признаки зависят от локализации этих клеток и их функционального состояния. Как уже отмечалось, основным отличительным признаком клеток ДЭС является наличие в цитоплазме секреторных гранул, которые являются окончательным местом образования и хранения пептидных гормонов, а также накопления биогенных аминов, синтез которых осуществляется в цитозоле клетки. Электронная микроскопия позволяет различать разные типы эндокринных клеток по содержащимся в их цитоплазме характерным гранулам и изучать ультраструктурные изменения на разных стадиях развития патологического процесса.

Зрелые секреторные гранулы представляют собой многокомпонентные структуры. Помимо активных пептидов и моноаминов, в гранулах содержатся предшественники пептидов и крупные белковые молекулы, АТФ и другие аденин-нуклеотиды. Именно этот сложный состав определяет размеры, форму и внутреннее строение секреторных гранул, идентифицируемых на ультраструктурном уровне, а также возможность применения различных гисто- и иммуногистохимических методов исследования. Специфичность строения гранул и их способность к осмофилии, аргентаффинность и аргирофилия служат ультраструктурными диагностическими признаками многих типов эндокринных клеток. Разработанная номенклатура клеток основана на ультраструктурном типе гранул и иммуногистохимической идентификации синтезируемого гормона. Отличить эндокринные гранулы от эндокринно-подобных (другой химической природы) позволяет ультраструктурный цитохимический метод уранаффинной реакции. При его использовании избирательно контрастируются гранулы эндокринных клеток, ядерный хроматин, ядрышки и рибосомы, а лизосомы, липофусциновые, лактальбуминовые и зимогенные гранулы не окрашиваются.

Усовершенствованные способы подготовки тканей, применение очищенных и моноклональных антител, введение в практику иммуноцитохимии в качестве электронно-плотной метки коллоидного золота позволяют в настоящее время не только изучать на ультраструктурном уровне одновременную локализацию нескольких гормонов в одной клетке, но и дифференцировать их внутри клетки по гранулам. Методы электронно-микроскопической иммуноцитохимии остаются достаточно трудоемкими и сложными для повседневной работы. Поэтому особый вклад в классификацию клеток ДЭС по секреторному продукту и виду эндокринных гранул внес простой и надежный способ изучения серийных полутонких-ультратонких срезов, при котором тип гормона идентифицируют иммуногистохимическим методом на полутонком срезе, а эндокринную клетку изучают после прицельной заточки блока на соответствующем ультратонком срезе. На полутонких срезах удобно проводить радиоавтографические исследования, а после удаления заливочной среды на них удается провести многие гисто- и иммуногистохимические реакции.

Комплексный анализ изучения функциональной морфологии эндокринных клеток основан на поэтапном применении гисто- и иммуногистохимических методов, радиоавтографии, общих и специальных методов, используемых в электронной микроскопии. Ключевая роль в установлении типа продуцируемого гормона и идентификации клеток ДЭС принадлежит иммуногистохимии. Вместе с тем некоторые гистохимические методы можно успешно применять для изучения ДЭС в целом и выявления отдельных типов эндокринных клеток. Но проводить исследования на ультраструктурном уровне из всех рассмотренных методов исследования позволяет только электронная микроскопия. Большинство известных эндокринных клеток идентифицировано именно в результате комплексных исследований, сочетающих гистохимические, иммуногистохимические и ультраструктурные методы анализа. Последовательное применение современных методов дает возможность изучать функциональное состояние популяции эндокринных клеток ДЭС как в норме, так и при патологии, анализировать эндокринную функцию той или иной клетки, определять ее тип и гормональный профиль, а также исследовать структурно-функциональные связи эндокринных клеток.


Оцените статью: (9 голосов)
4 5 9

Cтатьи из раздела Геронтология:


Гормоны, синтезируемые в желудочно-кишечном тракте, и их физиологические эффекты
Методологические аспекты исследования ультраструктуры нейроэндокринных клеток в модели радиационного старения
Мультифакторные нейроэндокринные регуляторные взаимодействия
Нейроэндокринные клетки желудка при естественном старении
Нейроэндокринные клетки желудка при хроническом атрофическом гастрите, ассоциированном со старением
Основные типы эндокринных клеток желудка и кишечника
Радиационные повреждения желудочно-кишечного тракта
2007-2017 © Copyright ООО «МЕДКАРТА». Все права на материалы, находящиеся на сайте medkarta.com,
охраняются в соответствии с законодательством РФ, в том числе, об авторском праве и смежных правах.