Методология исследования тимуса человека и животных при старении

фото Методология исследования тимуса человека и животных при старении
Верификация экспрессии гормонов в тимусе человека. Исследования выполнены на тимоцитах и ТЭК, выделенных из фрагментов тимуса детей в возрасте до 4 лет, полученных при операциях по устранению врожденных пороков сердца. В ряде опытов тимоциты и ТЭК выделяли также из фрагментов тимуса абортных эмбрионов человека на 20-недельном сроке развития. В качестве тимусных эпителиальных клеток (ТЭК) использовали клетки суспензионной линии VTEC2.H/S, полученные ранее Н. И. Шаровой (Институт иммунологии МЗ РФ) путем трансформации ТЭК эмбрионального тимуса человека материалом, содержащим вирус SV40, и последующего клонирования трансформированных клеток. Более 90% клеток VTEC2.H/S содержат цитокератины 8/18, что свидетельствует об их эпителиальной природе.

Мембранный фенотип клеток, в частности экспрессию молекул активации, оценивали методом проточной цитофлуорометрии с использованием моноклональных антител. Использовали моноклональные антитела фирм «Caltag» и «Becton Dickinson» к молекулам CD3, CD4 и CD8, меченные флуорохромами (обычно: анти-CD3-FITC, aнти-CD4-PE, анти-CDS-FITC). При анализе С04/С08-фенотипа тимоцитов наилучшие результаты достигались при одновременном закапывании антител в пробы с последующей инкубацией в течение 30 минут при температуре 2-8 °С.


Затем клетки отмывали, фиксировали параформом и анализировали на проточном цитометре. Фракционирование тимоцитов осуществляли с использованием ферромагнитных шариков фирмы «DYNAL» CD48 Positive Isolation Kit и CD8 Positive Isolation Kit. К суспензии тимоцитов добавляли магнитные шарики, отмытые в соответствии с инструкцией фирмы, в соотношении 3-5 шариков на выделяемую клетку (в наших опытах процедуру начинали с инкубации клеток с шариками, нагруженными aнти-CD4). Инкубировали в течение 20 минут при 4 °С в забуференном физиологическом растворе с 2% сыворотки эмбрионов телят при слабом помешивании. Затем пробирку помещали в магнит на 2-3 минуты. Собирали неприлипшие (негативные) клетки. Шарики отмывали.

Для отделения клеток к шарикам, суспензированным в среде RPNI 1640 с 1% сыворотки эмбрионов телят, добавляли раствор ДНКазы (50 ЕД/мл) и отделяли прилипшие клетки. Обе фракции клеток отмывали и добавляли фермент (DETACHaBEAD) — 10 мкл на 100 мкл суспензии клеток — и инкубировали 1 час при комнатной температуре и помешивании. Шарики отделяли от освободившихся клеток на магните.


Процедуру повторяли. Затем клетки «отрицательной» и «положительной» фракций аналогичным образом инкубировали с бусами, нагруженными другими моноклональными антителами (в наших опытах — анти-CD8). Для иммуноцитохимического исследования суспензию клеток фиксировали в смеси 4%-ного формальдегида и 0,1%-ного глутарового альдегида на фосфатно-солевом буфере (ФСБ), рН 7,4, в течение 3-5 минут и затем с помощью последовательного центрифугирования — ресуспендирования отмывали ФСБ.

После удаления фиксирующей смеси к суспензии на 20 минут добавляли 0,03%-ный Тритон Х-100 или 0,025%-ный сапонин для пермеабиализации клеточных мембран. Суспензию клеток инкубировали при 4 оС в холодильнике, периодически ресуспендируя. После удаления тритона/сапонина клетки два раза по 3 минуты отмывали ФСБ и готовили стандартные мазки на предметных стеклах. Иммуноцитохимические исследования проводили с использованием антител к различным гормонам. Маркерами пролиферативной активности клеток служили ядерный антиген пролиферирующих клеток (proliferative cell nuclear antigen — PCNA) и циклин A (Novocastra, 1:100).


Компьютерный анализ микроскопических изображений проводили с помощью системы Morphostar-2 (Imstar S.A.). Корреляционный анализ проводили с использованием программы Anova (Kruskal-Willis). Для статистической обработки результатов применяли программу Statistika 5.0 (Statsoft). Исследование старения клеток тимуса человека in vitro. Исследования in vitro проводились в культуре клеток тимуса и мононуклеаров периферической крови человека. Клетки тимуса культивировали 1 сутки, а моноиуклеары крови — 3 суток, как без стимуляции, так и в условиях стимуляции. Для этого тимоциты и ТЭК культивировали не только порознь (в монокультурах), но и совместно (в кокультурах с соотношением ТЭК/тимоциты, равном 1/10). Моноиуклеары стимулировали митогеном ФГА, который избирательно стимулирует Т-лимфоциты. Пептиды (вилон и эпиталон) вводили в культуры в концентрациях 2, 20 и 200 нг/мл.

Пролиферацию оценивали радиометрически по включению ЗН-тимидина. Проточную цитофлуорометрию осуществляли на проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson). Апоптоз оценивали цитофлуорометрически путем определения процента гиподиплоидных клеток с предварительной окраской фиксированных клеток йодидом пропидия. Экспрессию мембранных молекул (CD69, HLA-DR и CD54), которую использовали для оценки активации клеток, определяли с использованием набора моноклональных антител фирмы Caltag. Секрецию тимулина и цитокинов оценивали путем определения содержания в культуральных супернатантах исследуемых субстанций методом ELISA с использованием тест-наборов фирмы «Протеиновый контур». Все пробы ставились в триплетах. Аргирофильные белки областей ядрышковых организаторов (ОЯОР) выявляли в клетках с помощью метода их избирательной импрегнации. Учитывая различную экспрессию ОЯОР в тимоцитах и ТЭК, было подобрано оптимальное время инкубации для выявления аргирофильных белков, которое составляло для тимоцитов 15 минут, а для ТЭК — 10 минут.

Интенсивность экспрессии аргирофильных белков оценивали по количеству гранул серебра, образующихся в результате реакции. Для этого проводили морфометрические исследования с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений Nikon и лицензионной программы Videotest. Подсчет гранул проводили в 100 клетках при увеличении хЮОО и рассчитывали среднее число гранул серебра на 1 ядро тимоцита и ТЭК, определяя среднее количество гранул в каждой исследованной группе. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Statistika 5.0 (Statsoft). Исследование радиационного старения клеток тимуса крыс in vivo. Эксперименты in vivo выполнены на 40 самцах белых крыс линии Вистар в возрасте 2 месяцев, имеющих массу тела 180-200 г. Животные содержались в обычных условиях вивария при дневном освещении и сбалансированном рационе питания. Для моделирования преждевременного (ускоренного) старения использовали гамма-облучение на аппарате ЛУЧ-1 (источник 60Со; мощность дозы 17,166x10-4 Гр/с). Животные получали ежедневную дозу 6 Гр в течение 5 дней.

Все животные были разделены на 8 групп: 1 и 1а — интактные крысы; 2 и 2а — облученные крысы; 3 и За — облученные животные, которым вводился вилон; 4 и 4а — крысы, которым вводился вилон (без облучения). Вилон вводили подкожно животным 3, За, 4, 4а групп через 24 часа после первого сеанса облучения по 0,5 мкг (в 0,5 мл физиологического раствора) в течение 10 дней. Животным групп 2 и 2а вводилось эквивалентное количество физиологического раствора, по той же схеме. Эвтаназию животных и выделение тимуса проводили под нембуталовым наркозом (50 мг/кг) с соблюдением общепринятых правил. Тимус у животных групп 1-4 брали на 14-е сутки от начала эксперимента, а у групп 1а-4а — на 21-е сутки от начала эксперимента. Для светомикроскопических исследований кусочки тимуса фиксировали в течение 24 часов в кислой жидкости Буэна. Обзорную окраску препаратов осуществляли гематоксилином и эозином. Тучные клетки селективно окрашивали 1%-ным раствором толуидинового синего (Fluka) в 0,5М НС1 при рН 0,5. Для электронной микроскопии кусочки тимуса фиксировали по Карновскому. Ультратонкие срезы (100 нм), приготовленные на ультрамикротоме LKB-7A (LKB), контрастировали уранил-ацетатом и цитратом свинца. Электронно-микроскопическое исследование осуществляли в электронном микроскопе JEM-100S Geo0-

Для изучения пролиферативной активности клеток использовали мышиные моноклональные антитела к PCNA (клон РС10, Calbiochem, титр 1:50). Визуализацию иммуногистохимической реакции проводили авидин-биотин-пероксидазным методом с использованием набора для выявления мышиных иммуноглобулинов (ABP-kit, Vectastain). Морфометрические исследования выполнены с помощью системы компьютерного анализа микроскопических изображений Morphostar-2 (Imstar S.A.) с применением пакета лицензионных программ Colquant-2. Для каждого животного подсчет соответствующих структур проводили в 10 визуальных полях зрения по трем срезам. Тестовая площадь включала не менее 10 000 ядер тимоцитов. Тучные клетки в тимусе измеряли на площади не менее 5 мм2. Индекс пролиферативной активности (I PCNA) вычисляли по формуле: IPCNA(%) = N PCNA/N ядер х 100.


Оцените статью: (11 голосов)
4 5 11

Cтатьи из раздела Геронтология:


Нейроиммуноэндокринная регуляция пролиферативной активности тимоцитов человека
Пептидергическая геропротекция тимуса при преждевременном старении
Пептидергическая регуляция функций периферических Т-лимфоцитов
Пептидергическая регуляция функций тимоцитов
Пептидергическая регуляция функций эпителиальных клеток тимуса
2007-2017 © Copyright ООО «МЕДКАРТА». Все права на материалы, находящиеся на сайте medkarta.com,
охраняются в соответствии с законодательством РФ, в том числе, об авторском праве и смежных правах.