Метод исследования активности щелочной фосфатазы (ЩФ)

фото Метод исследования активности щелочной фосфатазы (ЩФ)
ЩФ — фосфогидролаза моноэфиров ортофосфорной кислоты, присутствует в каждом органе, больше всего вырабатывается в печени, костях, кишечнике, эндометрии (плаценте), легких. Активность фермента возрастает у детей в периоде быстрого роста, у женщин — в последнем триместре беременности, после менопаузы.

Располагается ЩФ на поверхности цитоплазматических мембран; наличие изоформ ЩФ в сыворотке крови связано с тем, что в организме человека биосинтез фермента кодируют три гена: печеночный, костный и почечный.

Принцип метода
Щелочная фосфатаза (щелочная фосфогидролипаза моноэстеров ортофосфорной кислоты) расщепляет в N-метил-D-глюкаминовом буфере 4-нитрофенилфосфат с образованием 4-нитрофенола и фосфата. Щелочная фосфатаза (ЩФ) активирована хлоридом натрия. Мерой каталитической концентрации фермента является количество освобожденного 4-нитрофенола, который определяют фотометрически, либо кинетическим методом, либо методом постоянного времени после остановки ферментативной реакции ингибитором ЩФ, который блокирует активный центр фермента.

Кинетическим методом можно без разведения анализировать сыворотки до каталитической концентрации ЩФ 30 мккат/л.


Методом константного времени можно без разведения анализировать пробы до 7 мккат/л. При каталитической концентрации ЩФ, превышающей эти величины, пробы следует развести физиологическим раствором и анализ произвести повторно (результат умножить на разведение). Объемы отдельных растворов и пробы можно модифицировать при условии соблюдения взаимных соотношений объемов, указанных в описании хода инкубационной смеси.

Пределы активности ЩФ при температуре 37 оС (мккат/л):

- мужчины — 0,90—2,29;

- женщины — 0,74—2,10;

- дети до 12 лет — 1,20—6,30.

Необходимые реактивы

1. п-нитрофениловый эфир фосфорной кислоты, динатриевая соль.

2. НСl, 0,001 моль/л.

3. п-Нитрофенилфосфат натрия, 4 г/л раствор в 0,001 моль/л раствора НСl: 0,4 г п-нитрофенилфосфата помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доливают до метки 0,001 моль/л раствором НСl. В связи с тем, что в продаже чаще имеется бариевая соль п-нитрофенилфосфата, то перевод ее в натриевую соль осуществляется следующим способом: к навеске п-нитрофенилфосфата бария, соответствующей получению 9 г/л раствора и помещенной в фарфоровую ступку, добавляют небольшими количествами 0,001 моль/л раствор НСl в процессе растирания соли в ступке в течение 10 мин.


Добавлением насыщенного раствора сульфата натрия (1 мл на 100 мл раствора) бариевую соль переводят в натриевую. Через 5 мин полученный раствор п-нитрофенилфосфата натрия фильтруют в делительную воронку, где затем взбалтывают с равным объемом водонасыщенного бутилового спирта. После разделения слоев жидкости в делительной воронке (вверху — бутанол, внизу — постепенно обесцвечивающийся субстратный раствор) бутанол выливают, а субстратный раствор подвергают описанной выше процедуре очистки еще 2—3 раза, пока он не станет совершенно бесцветным. После бутанола производят экстракцию водонасыщенным эфиром 1—2 раза. Реактив не должен содержать свободного п-нитрофенола, отсутствие которого в субстратном растворе проверяется следующей пробой: к 1 мл субстратного раствора прибавляют 10 мл 0,02 моль/л раствора едкого натра и измеряют на ФЭКе при длине волны 400—420 нм (фиолетовый светофильтр). Экстинкция должна быть меньше 0,08; если экстинкция больше 0,08, необходимо удалить свободный п-нитрофенол. Для этого реактив экстрагируют 2 или 3 раза равными объемами бутилового спирта и один раз — эфиром.


Затем удаляют следы эфира выдерживанием на воздухе. Бутиловый спирт и эфир должны иметь нейтральную реакцию. Если реактив не выдерживает указанный выше тест, то экстрагирование повторяют. Хранят раствор в холодильнике в замороженном состоянии в течение 2—3 недель.

4. Аминоуксусная кислота (гликокол, глицин).

5. Магния хлорида 6-водный.

6. Натр едкий; растворы 0,1 моль/л, 0,02 моль/л, не содержащие углекислого газа.

7. Буферный раствор — 0,05 моль/л глициновый буфер с добавлением катализатора хлорида магния — 95 мг/л: 375 мг глицина и 10 мг MgCl2 • 6Н2О растворяют в 42 мл 0,1 моль/л раствора едкого натра и доводят объем водой до 100 мл.

8. Субстратно-буферный раствор готовят смешиванием равных частей растворов 3 и 7, рН раствора 10,5. При смешивании 2 мл раствора с 10 мл 0,02 моль/л раствора едкого натра реактив не должен давать экстинкцию на ФЭКе более 0,1 (толщина слоя — 1 см, длина волны — 400—420 нм). В противном случае раствор негоден или подлежит реэкстрагированию бутанолом или эфиром. После экстракции необходимо снова установить рН. Хранят в холодильнике в течение 2—3 дней.

9. п-нитрофенол — калибровочный раствор 5 ґ 10–5 моль/л: 696 мг п-нитрофенола растворяют в 0,02 моль/л растворе едкого натра и доводят этим же раствором объем до 1 л; 1 мл раствора содержит 5 мкмолей п-нитрофенола.

Ход определения
Опытная проба: в пробирки вносят по 1 мл субстратно-буферного раствора, прогревают при температуре 37 °С в течение 5 мин, затем добавляют по 0,1 мл сыворотки. Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют в течение 30 мин при температуре 37 °С. После инкубации пробирки переносят в водяную баню со льдом, а затем добавляют по 10 мл 0,02 моль/л раствора едкого натра и тщательно перемешивают. Через 5 мин пробы измеряют на ФЭК при длине волны 400—420 нм (фиолетовый светофильтр) в кювете с толщиной слоя в 1 см против холостой пробы. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но сыворотку добавляют после инкубации.

Расчет производят по калибровочному графику.
Построение калибровочного графика. Из рабочего калибровочного раствора готовят ряд разведений, как указано ниже, и измеряют оптическую плотность растворов при условиях, аналогичных опытным, против 0,02 моль/л раствора едкого натра.

Клинико-диагностическое значение
Увеличение активности встречается при повышенном метаболизме в костной ткани: при заживлении переломов, при первичном и вторичном гиперпаратиреодизме (с явным вовлечением скелета), остеомаляции, недостатке витамина D в пище, заболеваниях костей.


Оцените статью: (12 голосов)
4.58 5 12

Cтатьи из раздела Лабораторные исследования:


Исследование гормонов
Исследование липидов
Исследование пигментов
Исследование углеводов
Исследование неорганических веществ
Исследование низкомолекулярных азотистых веществ
Исследование ферментов
2007-2017 © Copyright ООО «МЕДКАРТА». Все права на материалы, находящиеся на сайте medkarta.com,
охраняются в соответствии с законодательством РФ, в том числе, об авторском праве и смежных правах.