Метод исследования активности креатинкиназы (КК)

КК катализирует обратимую реакцию образования креатинфосфата из креатина и АТФ. Креатинфосфат является макроэргическим фосфатом, используемым мышцами для сокращения, расслабления и транспортировки метаболитов. Молекулы КК имеют свои особенности распределения в организме. Существуют три активных изофермента КК: мышечный изоэнзим-КК-ММ, сердечный изоэнзим-КК-МВ, мозговой изоэнзим-КК-ВВ.

Установлено, что в сыворотке крови здоровых людей активность ММ-изофермента составляет около 95% общей активности КК, и около 5% приходится на активность КК-МВ. При остром инфаркте миокарда спустя 4—6 ч после развития очага повышается активность КК. Максимум активности КК выявляется в течение 12—36 ч, увеличение активности происходит в основном в результате подъема активности КК-МВ.

Принцип метода
Креатинкиназа катализирует превращение креатинина в креатинфосфат. Ион фосфата, освобожденный при гидролизе креатинфосфата, определяют после депротеинирования как желтый комплекс фосфорно-ванадиево-молибденовой кислоты.

Посуда для определения креатинкиназы не должна содержать следы фосфатов.

Повторные внутримышечные инъекции могут вызвать значительное повышение концентрации креатинкиназы в сыворотке крови.

Пределы активности:

- мужчины — 10—65 Ед/л ґ 0,017 или 0,17—1,11 мккат/л;

- женщины — 7—55 Ед/л ґ 0,017 или 0,12—0,94 мккат/л.

Необходимые реактивы

1.


Аденозин-5-трифосфорной кислоты динатриевая соль.

2. L-цистеин, 0,024 моль/л: 2,9 мг растворяют в 1 мл воды. Готовят раствор перед употреблением. На одну пробу требуется 0,1 мл.

3. Креатин.

4. Магния сульфат 7-водный.

5. Аммоний молибденовокислый 4-водный, 0,02 моль/л: 2,5 г молибденовокислого аммония растворяют в мерной колбе в 70—80 мл воды и доводят объем до 100 мл водой.

6. Натрия сульфат безводный.

7. Натрий сернистокислый пиро (метабисульфит натрия).

8. 1-амино-2-нафтол-4-сульфокислота (эйконоген).

9. Серная кислота, 2,5 моль/л.

10. НСl, 0,1 моль/л.

11. Трис-(оксиметил)-аминометан (трис).

12. Трис-буфер, 0,133 моль/л, рН 9,0: 1,61 г трис растворяют в мерной колбе вместимостью 100 мл в 50—60 мл воды, устанавливают рН буфера 0,1 моль/л раствором НСl и доводят водой до метки.

13. Раствор эйконогена: 15,36 г пиросернистокислого натрия, 0,512 г сернистокислого натрия и 0,128 г эйконогена растворяют в 70—80 мл воды, взбалтывают, доводят объем водой в мерной колбе до 100 мл и дважды фильтруют (через 2 ч и через сутки после приготовления).


Раствор следует беречь от яркого света; в случае выпадения осадка вновь фильтруют. Стабилен в течение 1 месяца при хранении в холодильнике.

14. Основная смесь реактивов, содержащая 0,02 моль/л сульфата магния, 0,033 моль/л креатина и 0,0067 моль/л АТФ: 0,4920 г сульфата магния, 0,4326 г креатина и 0,3692 г АТФ растворяют в 70—80 мл трис-буфера (для полного растворения креатина смесь нагревают в течение 5—10 мин на водяной бане при температуре 40—45 °С). Затем объем основной смеси реактивов доводят трис-буфером в мерной колбе до 100 мл.

15. Трихлоруксусная кислота, 4,9 моль/л: 80 г ТХУ растворяют в 50—60 мл воды и объем раствора доводят в мерной колбе до 100 мл.

16. Смесь растворов для проведения кислотного гидролиза креатинфосфата. Смесь готовят перед употреблением, учитывая, что на одну пробу расходуют 2 мл. Смесь состоит из 0,25 мл раствора молибденовокислого аммония, 0,25 мл раствора серной кислоты и 1,5 мл воды (соотношение 1 : 1 : 6).

17. Калия фосфат однозамещенный безводный (для приготовления калибровочного раствора): 0,0169 г КН2РО4 растворяют в воде и объем раствора доводят в мерной колбе до 100 мл.

Специальное оборудование
Фотоэлектроколориметр

Ход определения
Предварительно все растворы реактивов прогревают в течение 5 мин при температуре 37 °С.


Опытная проба: в пробирку вносят 1,5 мл основной смеси реактивов, 0,1 мл раствора цистеина и 0,4 мл сыворотки крови. Содержимое пробирки осторожно перемешивают и ставят в термостат при температуре 37 °С на 30 мин. Затем прибавляют 0,2 мл раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают стеклянной палочкой и центрифугируют при скорости 3000 об./мин в течение 10 мин. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но сыворотку добавляют после прибавления раствора трихлоруксусной кислоты. Из опытной и холостой проб забирают по 1 мл надосадочной жидкости и переносят в химические пробирки (маркированные соответствующим образом), в которых содержится по 2 мл смеси растворов для проведения специфического гидролиза креатинфосфата. Полученную смесь растворов перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин (время гидролиза креатинфосфата). После этого в пробы добавляют с интервалом в 1 минуту по 0,25 мл раствора эйконогена и точно через 15 мин опытную пробу измеряют против холостой пробы при длине волны 600—700 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя в 0,5 см.

Расчет производят по калибровочному графику.


Построение калибровочного графика; готовят калибровочные пробы, как указано ниже.

Из каждого калибровочного раствора берут по 0,4 мл и обрабатывают, как опытные пробы. В холостую пробу вместо калибровочных растворов берут по 0,4 мл воды.

Примечание
Если активность КК превышает 500 нмоль/(с•л), то время инкубации сокращают до 15 или 10 мин; полученные величины активности умножают соответственно на 2 или 3. Разбавлять сыворотку не рекомендуется, так как активность фермента при разведении сыворотки изменяется непропорционально.

Клинико-диагностическое значение
Активность общей креатинкиназы повышается при многих заболеваниях: инфаркте миокарда, сахарном диабете, гипотиреозе, мышечных травмах, а также после внутримышечных инъекций, больших физических нагрузок, при дигитализации, хирургических вмешательствах, при мышечных дистрофиях всех типов, инфекционных болезнях, дефибрилляции, застойной сердечной недостаточности, тахикардии, эмболии легочной артерии, генерализованных судорогах, обширном инфаркте мозга, беременности, опухолях предстательной железы, мочевого пузыря, желудочно-кишечного тракта, отеке легкого, остром психозе, травмах головы, инфарктах желудочно-кишечного тракта.


Среди пациентов кардиологического отделения подъем активности КК имеет чувствительность 97%, специфичность 67% для инфаркта миокарда.


Оцените статью: (8 голосов)
3.63 5 8
2007-2017 © Copyright ООО «МЕДКАРТА». Все права на материалы, находящиеся на сайте medkarta.com,
охраняются в соответствии с законодательством РФ, в том числе, об авторском праве и смежных правах.