Определение активности аминотрансфераз (АЛТ, АСТ)

фото Определение активности аминотрансфераз (АЛТ, АСТ)
АЛТ (АлАТ) присутствует в очень больших количествах в печени и почках, в меньших — в скелетных мышцах и сердце. ACT (АсАТ) распределена во всех тканях тела. Наибольшая активность имеется в печени, сердце, скелетных мышцах и эритроцитах.

Принцип метода
Аспартат-аминотрансфераза катализирует реакцию между L-аспартатом и 2-оксоглутаратом, в результате которой они превращаются в L-глутамат и оксалацетат. Определение основано на измерении оптической плотности гидразонов 2-оксоглутаровой и пировиноградной кислоты в щелочной среде. Гидразон пировиноградной кислоты, возникающей при самопроизвольном декарбоксилировании оксалацетата, обладает более высокой оптической плотностью.

Аланин-аминотрансфераза катализирует реакцию между L-аланином и 2-оксоглутаратом, в результате которой они превращаются в L-глутамат и соль пировиноградной кислоты. Определение основано на измерении оптической плотности гидразонов 2-оксоглутаровой и пировиноградной кислоты в щелочной среде. Гидразон пировиноградной кислоты обладает более высокой оптической плотностью.

Повышенное содержание кетоновых тел (в сыворотках больных диабетом) вызывает завышение активности ферментов ACT и АЛТ.

Гемолиз повышает активность ACT или АЛТ в сыворотке крови. Снижение результатов вызывают синтетические моющие средства.

Пределы активности:

АЛТ 5 — 30 Е/л ґ 0,017 или 0,09—0,51 мккат/л;

ACT 7—18 Е/л ґ 0,017 или 0,12—0,31 мккат/л.

Метод определения активности АСТ

Необходимые реактивы

1.


Калия фосфат однозамещенный (КН2РО4).

2. Калия фосфат двузамещенный (К2НРО4 ґ 3Н2О).

3. L-аспарагиновая кислота или L-аспарагиновой кислоты натриевая соль.

4. Фосфатный буфер 0,1 моль/л, рН 7,4: 0,16 г однозамещенного фосфата калия и 2,07 г двузамещенного фосфата калия трехводного растворяют в 40—160 мл воды, проверяют рН и доводят водой в мерной колбе до 100 мл. Стабилен при хранении в холодильнике.

5. Субстратно-буферный раствор 0,25 моль/л L-аспарагиновой кислоты в 0,1 моль/л фосфатном буфере рН 7,4: 3,30 г L-аспарагиновой кислоты (или 3,9 г натриевой соли L-аспарагиновой кислоты) растворяют в 40—50 мл 0,1 моль/л фосфатного буфера, проверяют рН и доводят фосфатным буфером в мерной колбе до 100 мл. Если применяют L-acпaрагиновую кислоту, то к навеске перед растворением в фосфатном буфере для установления рН 7,4 добавляют примерно 20—26 мл 1 моль/л раствора едкого натра и затем проверяют рН. Стабилен при хранении в холодильнике в течение месяца.

6. β-никотинамидадениндинуклеотид восстановленный, динатриевая соль, 15 ммоль/л: 16 мг НАДH ґ Na2 ґ 4H2O растворяют в 1,5 мл воды. Раствор стабилен в течение 2 недель при хранении в темной посуде в холодильнике. Коэффициент молярного поглощения не ниже 5,6 ґ 102 м2 ∙ моль–1 при 340 нм.

7. α-κетоглутаровая кислота, 0,45 моль/л: 0,2 г α-кетоглутаровой кислоты растворяют в 2,5 мл воды и добавляют 5 моль/л раствора едкого натра.


Если используют динатриевую соль α-кетоглутаровой кислоты, то 0,26 г соли растворяют в 3 мл воды, раствор стабилен в течение 2 недель при хранении в холодильнике. α-кетоглутаровая кислота не должна содержать примесей пирувата и малата.

8. Малатдегидрогеназа из сердца свиньи (L-малат: NAD+ оксидоредуктаза). Суспензия в 50%-ном растворе глицерина. Специфическая каталитическая активность выше 17 ммоль/(с∙л). Примеси: АсАТ < 0,01%, ГлДГ < 0,003%, ЛДГ < 0,01%. Для приготовления рабочего раствора к 20 мкл суспензии добавляют 5 мл воды.

9. Лактатдегидрогеназа из скелетной мышцы кролика или свиньи. Суспензия в 50%-ном растворе глицерина. Специфическая каталитическая активность выше 8 ммоль/(с•л). Примеси: АсАТ < 0,01%, ГлДГ < 0,003%, АлАТ < 0,01%. Для приготовления рабочего раствора к 40 мкл суспензии добавляют 5 мл воды. Стабилен в течение 3 месяцев при хранении в холодильнике в хорошо укупоренной посуде.

10. Натр едкий, 5 моль/л; 1 моль/л.

11. Натрия хлорид, 154 ммоль/л (физиологический раствор).

Примечание
Для определения активности АсАТ и АлАТ по оптическому тесту используют отечественные реактивы или импортные, например, можно использовать реактивы фирмы “Reanal”. Все реактивы готовят на бидистиллированной воде, хранят при температуре от 0 до +4 °С. Уменьшение стабильности может наступить за счет роста микроорганизмов. Поэтому в растворы рекомендуется добавлять несколько капель хлороформа.

Специальное оборудование
Спектрофотометр с термостатированной кюветой.


Измерение проводят при 340 нм.

Ход определения

Перед определением температура растворов и сыворотки должна быть доведена до температуры измерения. Перед работой можно готовить смесь реактивов, состоящую из субстратно-буферного раствора, раствора НАДН, МДГ и ЛДГ в соотношении 60 : 1 : 1 : 1. Определение проводят по следующей схеме.

Перемешивают и через 60 сек. (лаг-фаза) измеряют экстинкцию и одновременно включают секундомер. Точно через 1, 2, 3 мин (или через более короткие, но равные промежутки времени) измеряют экстинкцию.

Поправку на холостой опыт проводят по формуле:

(ΔΕ/Δt)оп – (ΔΕ/Δt)хол = (ΔΕ/Δt)скор.

Скорректированную величину опытной пробы используют в дальнейших расчетах.

Расчет производят по формуле:

Активность, моль/(с∙м3) = нмоль/(с∙л) ґ 106 = Vр.с / ε ґ 1∙Vсыв ґ (ΔΕ / Δt)скор,

где Vр.с — объем реакционной смеси, мл;

Vсыв — объем сыворотки, мл;

t — время реакции, сек.;

ΔΕ / Δt — изменение экстинкции за 1 сек.;

ε — κоэффициент молярной экстинкции НАДН в м2 ґ моль–1;

1 — толщина слоя жидкости в кювете в метрах (1∙102).

Примечание
Определение активности фермента можно проводить по микрометоду. Для этого перед работой готовят смесь реактивов, состоящую из субстратно-буферного раствора, растворов НАДН, ЛДГ, МДГ в соотношении 60 : 1 : 1 : 1. Опытная проба включает смесь реактивов — 0,630 мл, сыворотку — 0,10 мл, α-кетоглутаровую кислоту — 0,02 мл. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но вместо сыворотки добавляют 154 ммоль/л раствор хлорида натрия. Определение проводят по той же схеме, что и в макрометоде.

Метод определения активности АЛТ

Необходимые реактивы

1. Калия фосфат однозамещенный (КН2РО4).

2. Калия фосфат двузамещенный (К2НРО4 ґ 3Н2О).

3. Фосфатный буфер, 0,1 моль/л, рН 7,4: 0,16 г однозамещенного фосфата калия и 2,07 г двузамещенного фосфата калия трехводного растворяют в 40—60 мл воды, проверяют рН и доводят водой в мерной колбе до 100 мл. Стабилен при хранении в холодильнике.

4. L-aльфа-аланин.

5. Субстратно-буферный раствор, 0,63 моль/л L-аланина в 0,1 моль/л фосфатном буфере, рН 7,4: 5,62 г L-аланина растворяют в 80 мл 0,1 моль/л фосфатного буфера, проверяют рН и доводят фосфатным буфером в мерной колбе до 100 мл. Стабилен в течение 2 месяцев при хранении в холодильнике.

6. β-никотинамидадениндинуклеотид восстановленный, динатриевая соль, 15 ммоль/л (коэффициент молярной экстинкции не ниже 5,6 ґ 102 м2 ґ моль–1 при 340 нм): 16 мг НАДН ґ Na2 4H2O растворяют в 1,5 мл воды. Раствор стабилен в течение 2 недель при хранении в темной посуде в холодильнике.

7. Натр едкий, 5 моль/л.

8. α-κетоглутаровая кислота, 0,56 моль/л: 0,245 г α-кетоглутаровой кислоты растворяют в 2,5 мл воды и добавляют 0,5 мл 5 моль/л раствора едкого натра. Если используют динатриевую соль α-кетоглутаровой кислоты, то 0,318 г соли растворяют в 3 мл воды. Раствор стабилен в течение 2 недель при хранении в холодильнике.

9. Лактатдегидрогеназа из скелетной мышцы кролика или свиньи, суспензия в 50% растворе глицерина. Специфическая каталитическая активность выше 8 ммоль/(с•л). Примеси: АсАТ < 0,01%, ГлДГ < 0,003%, АлАТ < 0,01%. Для приготовления рабочего раствора к 45 мкл суспензии добавляют 5 мл воды. Стабилен в течение 3 месяцев при хранении в холодильнике.

10. Натрия хлорид, 154 ммоль/л (физиологический раствор).

Все реактивы лучше готовить на бидистиллированной воде.

Специальное оборудование то же, что для АсАТ.

Ход определения

Перед определением температура растворов и сыворотки должна быть доведена до температуры измерения. Перед работой можно готовить смесь реактивов, состоящую из субстратно-буферного раствора, раствора НАДН и ЛДГ в соотношении 60 : 1 : 1. Определение проводят по следующей схеме (табл. 12).

Перемешивают, через 60 сек. (лаг-фаза) измеряют экстинкцию и одновременно включают секундомер. Точно через 1, 2, 3 мин (или через более короткие, но равные промежутки времени) измеряют экстинкцию. Измерение опытной и холостой проб проводят против воды при 340 нм в кювете с толщиной слоя в 1 см.

Поправку на холостой опыт проводят по формуле:

(ΔΕ/Δt)оп – (ΔΕ/Δt)хол = (ΔΕ/Δt)скор.

Скорректированную величину опытной пробы используют в дальнейших расчетах. Расчет производят по формуле:

активность, моль/(с∙м3) = нмоль/(с∙л) ґ 106 = V/ε ґ 1∙V ґ (ΔΕ/Δt)скор.

Условные обозначения те же, что для определения АсАТ.

Примечание
Определение активности фермента можно проводить по микрометоду. Для этого перед работой готовят смесь реактивов, состоящую из субстратно-буферного раствора, растворов НАДН и ЛДГ в соотношении 60 : 1 : 2. Опытная проба включает: смесь реактивов — 0,630 мл; сыворотку — 0,10 мл; α-кетоглутаровую кислоту — 0,02 мл. Определение проводят по той же схеме, что и в макрометоде.

Клинико-диагностическое значение
Значительное повышение активности АЛТ (в два раза выше нормы и более) развивается при некрозе печеночных клеток любого происхождения, тяжелом шоке, правосердечной недостаточности, острой аноксии, обширной травме печени, левосердечной недостаточности. Подъем активности имеет место также при циррозе печени, механической желтухе, опухоли печени, обширном инфаркте миокарда, миокардите, миозите, мышечной дистрофии. Иногда активность увеличивается при гемолитической болезни, преэклампсии, умеренной мышечной травме, жировой печени, хроническом алкоголизме, тяжелых ожогах, выраженном панкреатите.

Значительное повышение активности ACT развивается при гепатитах вирусного происхождения. Подъем активности имеет место также при некрозе клеток печени или их повреждении любой этиологии, включая холестатическую и обструктивную желтуху, хронические гепатиты, лекарственное повреждение печени, алкогольный гепатит (обычно ACT более АЛТ), вирусные и хронические гепатиты (АЛТ более ACT в большинстве случаев, плохой прогноз при ACT более АЛТ); метастазах в печень и гепатомах, инфекционном мононуклеозе, некрозе или травме сердечной или скелетной мышцы, воспалительных заболеваниях скелетной или сердечной мышцы, после острого инфаркта миокарда (ACT более АЛТ), тяжелой физической нагрузке, сердечной недостаточности, тяжелых ожогах, тепловом ударе, гипотиреозе (40—90% случаев), обструкции кишечника, молочнокислом ацидозе, злокачественной гипотермии, посткомиссуротомном синдроме, ревматической полимиалгии, тифоидной лихорадке, большой талассемии, токсическом шоке.


Оцените статью: (12 голосов)
3.42 5 12

2007-2016 © Copyright ООО «МЕДКАРТА». Все права на материалы, находящиеся на сайте medkarta.com,
охраняются в соответствии с законодательством РФ, в том числе, об авторском праве и смежных правах.