Унифицированный метод по диазореакции в присутствии акселератора (метод Ендрассика—Клеггорна—Грофа)

фото Унифицированный метод по диазореакции в присутствии акселератора (метод Ендрассика—Клеггорна—Грофа)
Принцип метода

Под воздействием НСl разрывается тетрапирроловая связь билирубина и образуются два дипиррола, которые диазотируются диазобензосульфоновой кислотой с образованием розово-фиолетового азобилирубина. Связанный билирубин реагирует быстро, несвязанный билирубин реагирует после добавления кофеинового реактива.

Необходимые реактивы

1. Кофеин.

2. Натрия бензоат.

3. Натрия ацетат 3-водный.

4. Кофеиновый реактив: 5 г кофеина, 7,5 г бензоата натрия, 12,5 г ацетата натрия растворяют в 90 мл воды, нагревают до температуры 50—60 °С, хорошо перемешивают. После охлаждения доливают водой до 100 мл. Раствор стабилен в течение 2 недель.

5. Натрия хлорид, 154 ммоль/л (изотонический раствор): 0,9 г хлорида натрия помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доливают до метки водой.

6. НСl концентрированная.

7. Сульфаниловая кислота.

8. Диазосмесь. Диазореактив I: 5 г сульфаниловой кислоты растворяют при нагревании в 300—400 мл воды, прибавляют 15 мл концентрированной НСl. Если сульфаниловая кислота полностью не растворяется, колбу помещают в теплую воду и помешивают. Только после растворения и охлаждения раствор доливают водой до 1 л. Реактив стабилен при хранении в посуде из темного стекла. Диазореактив II: натрия нитрит, 5 г/л (0,07 моль/л): 0,5 г нитрита натрия помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доливают водой до метки.


Реактив стабилен в течение 2—3 недель. при хранении в посуде из темного стекла. Перед работой смешивают 10 мл диазореактива I и 0,3 мл диазореактива II.

9. Билирубин для построения калибровочного графика, 800 мг/л, или 1 368 мкмоль/л. Коммерческие препараты кристаллического билирубина содержат разные примеси, которые могут мешать реакции азосочетания. Рекомендуется использовать набор Био-Ла-Тест “Билирубин-эталон”, содержащий билирубин высокой степени чистоты с коэффициентом молярной экстинкции не менее 6,05 ґ 104 л при 453 нм и растворении в хлороформе. Растворы билирубина нестойкие, поэтому их готовят с добавлением белка в качестве стабилизатора. Коммерческие препараты билирубина не связаны с глюкуроновой кислотой.

10. Натрия карбонат, 0,1 моль/л: 10,6 г безводного NаСО3 растворяют и доливают до 1 л водой.

11. Уксусная кислота, 4 моль/л: 25 мл ледяной уксусной кислоты доливают до 100 мл водой.

Ход определения

В 3 пробирки (2 опытные пробы и холостая) вводят реактивы, как указано в таблице.

Для определения связанного билирубина измерение проводят спустя 5—10 мин после добавления диазосмеси, так как при длительном стоянии в реакцию вступает несвязанный билирубин. Для определения общего билирубина пробу для развития окраски оставляют стоять 20 мин, после чего измеряют на фотометре. При дальнейшем стоянии окраска не изменяется.

Измерение проводят при длине волны 500—560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя в 0,5 см против воды.


Из показателей, полученных при измерении общего и связанного билирубина, вычитают показатель холостой пробы.

Расчет производят по калибровочному графику. Находят содержание общего и связанного билирубина.

Построение калибровочного графика

Способ I — Шелонга-Вендес использованием стабилизирующего свойства белка сыворотки крови. Основной раствор билирубина: в колбе вместимостью 50 мл растворяют 40 мг билирубина в 30—35 мл 0,1 моль/л раствора карбоната натрия Na2CO3. Хорошо взбалтывают, не допуская образования пузырьков. Доводят до 50 мл 0,1 моль/л раствором Nа2СО3 и несколько раз перемешивают. Раствор стоек только в течение 10 мин от начала приготовления. В дальнейшем происходит окисление билирубина.

Рабочий раствор билирубина: к 13,9 мл свежей негемолизированной сыворотки здорового человека добавляют 2 мл свежеприготовленного основного раствора билирубина и 0,1 мл 4 моль/л раствора уксусной кислоты. Хорошо перемешивают. При этом выделяются пузырьки углекислого газа. Рабочий раствор стоек в течение нескольких дней. Этот раствор содержит точно на 100 мг/л, или 171 мкмоль/л, билирубина больше, чем сыворотка, взятая для приготовления раствора. Чтобы исключить при расчетах количество билирубина, содержащегося в этой сыворотке, при измерении на фотометре из величин экстинкции калибровочных проб вычитают величины экстинкции соответствующих разведений компенсационной жидкости.

Для приготовления компенсационной жидкости смешивают 13,9 мл той же сыворотки, которая использовалась для приготовления калибровочного раствора билирубина, 2 мл 0,1 моль/л раствора карбоната натрия и 0,1 мл 4 моль/л раствора уксусной кислоты.


Для построения калибровочного графика готовят ряд разведений с различным содержанием билирубина.

К полученным разведениям прибавляют по 1,75 мл кофеинового реактива и по 0,25 мл диазосмеси. При появлении помутнения можно добавить по 3 капли 30%-ного раствора едкого натра. Измерение проводят при тех же условиях, что и в опытных пробах, через 20 мин.

Из компенсационной жидкости готовят разведения, аналогичные калибровочным (как указано ниже), и далее обрабатывают их так же, как калибровочные пробы.

Способ II — калибровочный график строится по готовому набору реактивов “Билирубин-эталон” (“Лахема”).

Набор Био-Ла-Тест “Билирубин-эталон” включает:

1) билирубин лиофилизированный (точная концентрация билирубина приведена на этикетке флакона);

2) альбумин лиофилизированный.

Способ приготовления растворов билирубина указан в инструкции к набору.

Калибровочная кривая линейна до 170 мкмоль/л.

Примечание

На правильность метода влияет способ построения калибровочной кривой. Ряд веществ — гидрокортизон, андрогены, эритромицин, глюкокортикоиды, фенобарбитал, аскорбиновая кислота — вызывают интерференцию.

Клинико-диагностическое значение

При печеночных желтухах (гепатиты, циррозы) в крови отмечается резкое увеличение содержания билирубинглюкуронида, происходящее главным образом от разрушения печеночных клеток.


Повреждение мембран гепатоцитов приводит к выходу в кровь и прямого, и непрямого билирубина.

Некоторое возрастание количества свободного билирубина наступает вследствие нарушения функции печени (уменьшение активности трансглюкуронидазы и других ферментных систем, участвующих в глюкуронидировании).

Значительное увеличение содержания билирубина сыворотки при механических (застойных) желтухах обусловлено переполнением желчных путей вследствие закупорки, разрыва их и перехода желчи в русло крови. Обтурационные желтухи сопровождаются резким увеличением прямого билирубина в крови. Длительный застой желчи в печени может вызвать воспалительные изменения в гепатоцитах с последующим увеличением содержания непрямого билирубина сыворотки крови.

Резкое возрастание количества свободного билирубина при гемолитической желтухе происходит в результате гемолиза, приводящего к усиленному образованию непрямого билирубина.


Оцените статью: (9 голосов)
3.33 5 9
2007-2017 © Copyright ООО «МЕДКАРТА». Все права на материалы, находящиеся на сайте medkarta.com,
охраняются в соответствии с законодательством РФ, в том числе, об авторском праве и смежных правах.