Ферментативный (уреазный) метод определения мочевины

фото Ферментативный (уреазный) метод определения мочевины
Принцип метода

Мочевина под действием уреазы разлагается на углекислый газ и аммиак, который в щелочной среде с гипохлоритом натрия и фенолом образует индофенол синего цвета (метод Бертло). Светопоглощение образовавшегося продукта пропорционально содержанию мочевины в образце.

Необходимые реактивы

1. Уреаза. Для определения пригодна уреаза с активностью > 5 МЕ/мг.

2. Этилендиамин-N, N, N', N'-тетрауксусной кислоты динатриевая соль (трилон Б).

3. ЭДТА-буфер, 0,0269 моль/л, рН 6,5 : 0,50 г трилона Б растворяют в 30—40 мл воды, доводят рН до 6,5 1 моль/л раствором едкого натра и доливают водой в мерной колбе до 50 мл.

4. Основной раствор уреазы в буфере, 10 МЕ/мл: 20 мг уреазы (активность 5 МЕ/мг) растворяют в 10 мл буфера. Навеску уреазы берут в зависимости от активности фермента. Раствор стабилен в течение месяца при хранении в холодильнике.

5. Рабочий раствор уреазы. Перед началом определения берут необходимое количество основного раствора уреазы и разводят бидистиллированной водой в отношении 1 : 4.

6. Фенол.

7. Натрия нитропруссид 2-водный.

8. Цветной реактив: фенол — 0,11 моль/л, нитропруссид натрия — 0,18 моль/л: 0,0263 г нитропруссида натрия помещают в мерную колбу вместимостью 500 мл, приливают примерно 300 мл воды, растворяют при перемешивании. Затем добавляют 5,18 г фенола и доливают водой до метки. Реактив стабилен в течение месяца при хранении в холодильнике в посуде из темного стекла.

9. Натр едкий, 1 моль/л; 0,26 моль/л.

10. Гипохлорит натрия. Приготовление основного раствора гипохлорита: 100 г хлорной извести размешивают в течение 15 мин с 170 мл воды, после чего прибавляют при непрерывном помешивании раствор, состоящий из 170 мл воды и 70 г карбоната натрия.


Масса сначала густеет, затем разжижается. Оставляют стоять до следующего дня. Надосадочную жидкость (гипохлорит натрия) сливают и фильтруют через промытый водой фильтр. Хранят в холодильнике в посуде из темного стекла. Определение активности хлора: 1 мл основного раствора гипохлорита натрия смешивают с 100 мл воды. К 50 мл этого раствора добавляют 5 мл свежеприготовленного 50 г/л раствора йодида калия и 10 мл 6 моль/л раствора НСl. Титруют 0,1 н раствором тиосульфата натрия (готовят из фиксанала). Как только раствор приобретает слабо-желтую окраску, добавляют 10 капель 1%-ного раствора крахмала и титруют до обесцвечивания. Концентрацию гипохлорита натрия рассчитывают по хлору:

К = а ґ 0,709,
где К — концентрация активного хлора, г/100 мл гипохлорита натрия;

а — количество тиосульфата, пошедшего на титрование, мл;

0,709 — коэффициент пересчета 1 мл тиосульфата натрия в концентрацию хлора, г/100 мл.
11. Рабочий раствор гипохлорита натрия. После установления концентрации активного хлора основной раствор гипохлорита натрия разводят водой так, чтобы концентрация хлора составляла 0,78 г/л. Раствор гипохлорита с содержанием хлора 0,78 г/л смешивают с равным объемом 0,26 моль/л раствором едкого натра (100 мл + 100 мл). Активность хлора проверяют не реже одного раза в 2 недели. Рабочий раствор содержит 0,011 моль/л гипохлорита и 0,13 моль/л едкого натра. Раствор хранят в холодильнике в посуде из темного стекла.

12. Мочевина.

13. Бензойная кислота, 2 г/л (кислоту растворяют при нагревании).

14. Калибровочный раствор мочевины, 0,5 ммоль/л: 15 мг мочевины растворяют в мерной колбе вместимостью 500 мл в 2 г/л растворе бензойной кислоты.


Раствор стабилен при хранении в холодильнике.

15. Натрия хлорид, 0,154 моль/л.

Специальное оборудование

1. Спектрофотометр или колориметр с кюветой для микроизмерений.

2. Полуавтоматические микропипетки.

Ход определения

Перед определением сыворотку разводят 0,154 моль/л раствором хлорида натрия в отношении 1 : 9.

Опытная проба: 100 мкл рабочего раствора уреазы вносят в пробирку, добавляют 20 мкл разведенной сыворотки. Закрывают пробкой, перемешивают и инкубируют в течение 15 мин при температуре 37 °С. После инкубации добавляют 300 мкл цветного реактива и 300 мкл рабочего раствора гипохлорита натрия. Перемешивают и инкубируют в течение 20—30 мин при температуре 37 °С. Измеряют экстинкцию в кювете с толщиной слоя в 1 см при длине волны 500—560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы. Окраска стабильна в течение нескольких часов.

Холостую пробу обрабатывают так же, как опытную, но вместо сыворотки берут 0,154 моль/л раствор NaCl.

Калибровочную пробу обрабатывают так же, как опытную, но вместо сыворотки берут калибровочный раствор мочевины. Измеряют при тех же условиях против холостой пробы.

Расчет количество мочевины в ммоль/л ведут по формуле:

Еоп / Ек ґ 0,5 ґ 10,
где Еоп — экстинкция опытной пробы;

Ек — экстинкция калибровочной пробы;

0,5 — концентрация мочевины в калибровочном растворе, ммоль/л;

10 — коэффициент разведения.
Линейная зависимость между оптической плотностью и концентрацией мочевины сохраняется до 33 ммоль/л.

Примечание

Объемы сыворотки и реактивов можно пропорционально увеличивать.

Содержание мочевины сыворотки крови — 2,5—8,3 ммоль/л; мочевина суточной мочи — 333—583 ммоль/л.

Верхняя граница содержания мочевины в сыворотке крови зависит от приема белков с пищей.


При приеме белков свыше 2,5 г/кг живой массы в сутки верхняя граница референтных величин содержания мочевины в сыворотке может быть повышена даже до 10 ммоль/л.

Клинико-диагностическое значение

При трактовке результатов анализа следует исходить из того, что диета с низким содержанием белка может уменьшить концентрацию мочевины, и наоборот, избыточное питание азотистыми продуктами повышает уровень мочевины. Диета, бедная ионами хлора, также нередко приводит к повышению концентрации мочевины. Поэтому в большинстве случаев повышение концентрации мочевины до 12 ммоль/л считается физиологически допустимым. Однако существует мнение, что всякое повышение мочевины в крови выше 10 ммоль/л нужно рассматривать выходящим за пределы нормы, так как едва ли какой-либо пищевой режим способен поднять содержание мочевины крови выше этого уровня при отсутствии выделительных расстройств. Из других физиологических состояний следует отметить беременность, при которой концентрация мочевины в крови часто падает ниже 4,5 ммоль/л.

Повышение уровня мочевины в сыворотке крови наблюдается не только при почечной недостаточности, но и при ряде других патологических состояний: рефлекторной анурии, камнях и злокачественных новообразованиях в мочевыводящих путях, болезни предстательной железы, отравлении сулемой, болезни Аддисона, усиленном распаде белков (острой желтой атрофии печени, тяжелых инфекционных заболеваниях: брюшном тифе, холере и др.), при непроходимости кишечника (илеусе), перитоните, шоке, ожогах, обеднении организма ионами хлора (хлорипривная азотемия, уремия), а также при дизентерии, обезвоживании (в последнем случае уремия носит не абсолютный, а относительный характер).


Поскольку мочевина образуется главным образом в печени (существует мнение, что синтезировать мочевину в небольших количествах могут и другие ткани), вполне понятно, что при ее заболеваниях в первую очередь страдает мочевинообразовательная функция. Поэтому при паренхиматозной желтухе, острой дистрофии печени, декомпенсированном циррозе уровень мочевины в крови уменьшается, хотя концентрация остаточного азота при этом может не изменяться или даже несколько увеличиваться (за счет возрастания содержания азота аминокислот и аммиака). Особенно показательно в этом отношении изменение коэффициента urea ratio (азот мочевины / остаточный азот ґ 100, норма — 48—60%, при хронических нефритах возрастает до 90% и более), который резко снижается (в противоположность значительному повышению при недостаточности почек). Повышение содержания мочевины в моче наблюдается при злокачественной анемии, лихорадке, гиперпротеиновой диете, после приема салицилатов, хинина, при отравлении фосфором; пониженное — при уремии, нефрите, ацидозе, паренхиматозной желтухе, острой дистрофии печени, прогрессирующем циррозе.


Оцените статью: (9 голосов)
4.11 5 9
2007-2017 © Copyright ООО «МЕДКАРТА». Все права на материалы, находящиеся на сайте medkarta.com,
охраняются в соответствии с законодательством РФ, в том числе, об авторском праве и смежных правах.